不同冷冻保藏条件对Glarealozoyensis生长及产纽莫康定B0能力的影响

秦婷婷, 袁 恺, 王晓婷, 宋 萍*, 黄 和

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院,江苏 南京 211816；2.南京工业大学 药学院,江苏 南京 211816)

《微生物学杂志》由中国微生物学会、辽宁省微生物学会、辽宁省微生物科学研究院主办，为中国科技论文核心期刊、中国生物学核心期刊，被美国《化学文摘(CA)》、《英联邦农业文摘(CAB)》、《中国生物学文摘》、中国科学引文数据库、CNKI中国期刊全文数据库、中国核心期刊(遴选)数据库等国内外重要检索刊物及数据库摘引和收录，是包括工业微生物学、农业微生物学、医学微生物学、兽医微生物学、生物质资源、食用菌学、生物工程学、加工技术及各相关领域的综合性刊物，是国内外科研人员、大中专院校师生、企业人士、医生及生物学爱好者必读的刊物。

《微生物学杂志》创刊于1978年，国内外发行，双月刊。发行面覆盖国内各地的图书馆、科研院所、高校、企业、医院及港、澳、台、北美、澳州、西欧、日本、东南亚等地。

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不同冷冻保藏条件对Glarealozoyensis生长及产纽莫康定B0能力的影响

秦婷婷1, 袁 恺1, 王晓婷2, 宋 萍1*, 黄 和2

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院,江苏 南京 211816；2.南京工业大学 药学院,江苏 南京 211816)

棘白菌素类化合物纽莫康定B0生产菌株Glarealozoyensis，在其连续传代和发酵过程中都观察到菌株的变异，给科研、生产带来极大困扰。因此，采用低温冷冻保藏对G.lozoyensisQ1进行长期保存。采用单因素实验法研究了低温保护剂类型、保藏温度以及低温保护剂浓度对G.lozoyensisQ1菌体形态和发酵性能的影响。以作用于全细胞的80 g/L甘油和作用于细胞壁外的200 g/L PEG-6000作为低温保护剂，在-80 ℃保藏3个月后，纽莫康定B0产量达到1.6 g/L,与保藏前基本一致。并且，当菌体保藏过后菌丝形态能维持一定褶皱的实验组产量均能保持在1 g/L以上，当表面趋于光滑时产量急剧下降，仅为初始的25%左右。结果表明，以甘油及PEG-6000作为冷冻保护剂，在-80 ℃条件下可实现G.lozoyensisQ1长期保藏。

Glarealozoyensis；纽莫康定B0；冷冻保藏；菌丝形态

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 本实验室保藏菌株G.lozoyensisQ1。

1.1.2 培养基(g/L) 固体培养基：葡萄糖30，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，玉米浆15，微量元素溶液10 mL(微量元素溶液(g/L)：FeSO4·7H2O 1.0， ZnSO4·7 H2O 0.2，CaCl20.0756， H3BO30.056，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.2)，琼脂22，pH 6.8；种子培养基：葡萄糖10，大豆粉20，玉米浆10，KH2PO41.0，微量元素溶液 10 mL，pH 5.0；发酵培养基：甘露醇80，玉米粉10，K2HPO42.5，pH 6.8；以上培养基均在0.1 MPa、121 ℃、保温30 min灭菌，备用。

1.2 方法

1.2.1 培养条件 ①摇瓶种子培养：从斜面培养基取2 cm2菌落，接种至装有50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，25 ℃、220 r/min培养5 d；②摇瓶发酵培养：取培养5 d的种子液5 mL，接种至装有50 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，25 ℃、220 r/min培养15 d，获得纽莫康定B0发酵液；③平板种子培养：25 ℃恒温培养箱培养15 d。

1.2.2 低温保藏方法 ①将生长5 d的种子培养液分别与配置好的不同类型的低温保护剂按6∶4的体积比保藏于10 mL菌株保藏管中，并置于-80 ℃冰箱保藏3个月。②将生长5 d的种子培养液与10%终浓度甘油及20%终浓度PEG-6000保藏于10 mL菌株保藏管中，分别置于4、-20、-80 ℃的冷藏设施中保藏3个月；③将生长5 d的种子培养液分别与配置好的不同浓度甘油、PEG-6000以及甘油和PEG-6000的混合物按6∶4的体积比保藏于10 mL菌株保藏管中保藏3个月。

1.2.3 细胞干重测定 取发酵液5 mL于离心管中，8 000 r/min离心10 min，弃上清，菌体在80 ℃烘干48 h至恒重后称重。

1.2.4 发酵液中甘露醇含量测定 取发酵液1 mL，8 000 r/min离心10 min，上清液稀释10倍后使用液相色谱进行分析。采用岛津高效液相色谱LCsolution工作站测定，色谱柱：Aminex HPX-87P柱(300 mm×7.8 mm)，流动相：超纯水，流速：1 mL/min，检测器：示差折光检测器(RID-10A)，柱温：80 ℃，进样量：20 μL。

1.2.5 发酵液中纽莫康定B0的测定 取发酵液1 mL，加入4 mL无水乙醇，漩涡震荡器震荡10 min，8 000 r/min离心2 min，上清用液相色谱进行分析。戴安高效液相色谱U3000测定，色谱柱：Venusil MP C18柱(250 mm×4.6 mm)；流动相A：乙腈，流动相B：0.3%的磷酸；洗脱程序：0 min，A∶B = 50∶50；0 ～ 10 min，A∶B = 25∶75;10～15 min，A∶B = 5∶95;15～20 min，A∶B = 5∶95;20 min，A∶B = 50∶50；20～25 min，A∶B=50∶50；流速1 mL/min；检测器：紫外检测器；检测波长：210 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。

2 结果与分析

2.1G.lozoyensisQ1菌株自发变异现象

纽莫康定B0的生产菌株是Glarealozoyensis，其最大缺点是不稳定，易自发突变，影响纽莫康定B0的合成。在连续传代和发酵过程中都观察到菌株的变异，出现大(L)、小(S)两种菌落(图1)，其中S型菌落产生的纽莫康定B0收率正常，而L型产生的纽莫康定B0收率低。因而，单纯通过菌种的间断性活化来维持细胞生物活性，不仅可能增加生产菌株被污染的风险，更会极大地提高菌种自发突变的几率，导致菌种生产能力退化[6,13]。因此，选择一种能持久稳定细胞的生物活性，维持生产菌株发酵水平的方法显得十分重要。

图1 G. lozoyensis Q1不同表型菌株(L型(左)和S型(右))Fig.1 G. lozoyensis Q1with different phenotypes(L type(left)and S type(right))

2.2 不同类型低温保护剂对G.lozoyensisQ1发酵性能的影响

由于G.lozoyensisQ1菌株是一种海洋丝状真菌，具有细胞壁和细胞膜，因此选择低温保护剂甘油、海藻糖、蔗糖以及PEG-6000，并考察了不同低温保护剂类型对G.lozoyensisQ1生物量、底物消耗以及纽莫康定B0生物合成三个方面的影响。如图2所示，未添加低温保护剂，发酵结束时生物量降低11%，说明G.lozoyensisQ1在-80 ℃条件下不添加任何低温保护剂，对菌体生长有抑制作用。分析纽莫康定B0产量数据可以发现，经过3个月的低温保藏后，除了5%甘油、10%甘油以及20% PEG-6000三个实验组维持保藏前的产量，其余实验组的产量均出现不同比例的下降。从甘露醇消耗趋势可以发现，10%～40% PEG-6000对G.lozoyensisQ1甘露醇消耗速率影响最小，其他类型保护剂的甘露醇消耗速率均受到抑制，其中40%甘油与40%的蔗糖实验组，15 d发酵结束时甘露醇剩余量超过40 g/L,即甘露醇消耗水平不到未保藏前的50%，说明低温保护剂会影响菌种发酵活性，过高的浓度会抑制菌体生长速率。

比较不同类型的低温保护剂，当保护剂作用区域位于全细胞时(如甘油等)，对G.lozoyensisQ1发酵活力的保护作用最佳，其次为保护剂作用于细胞壁外(如PEG-6000等)，即当保护剂穿过细胞壁停留细胞膜外时(如蔗糖和海藻糖等)。-80 ℃保藏条件下 5%～10%的甘油以及20% PEG-6000三个浓度低温保护剂对G.lozoyensisQ1 发酵活力维持效果最好，低温保藏3个月后维持95%以上的纽莫康定B0产量。

2.3 不同保藏温度对发酵的影响

细胞在低温条件下内部的生理代谢活力会降低甚至进入休眠，恢复正常生长条件时仍能维持菌体活力，从而实现长时间维持菌体活力的目的。由图3可以看出G.lozoyensisQ1在10%的甘油实验组中，-20 ℃与-80 ℃实验组能维持较好的发酵性能，4 ℃的恢复效果最差，最大生物量较其他实验组相差不大，但发酵产量仅为-20 ℃和-80 ℃的58.9%。在20%的PEG-6000实验组中，随着保藏温度的降低，纽莫康定B0发酵性能恢复效果不断提高，-80 ℃条件下产量为4 ℃的142.9%。10%甘油的冻存保护剂浓度在-20 ℃和-80 ℃条件下低温保藏3个月，纽莫康定B0产量未发生明显变化，可以在实际应用中使用-20 ℃进行短期保藏，相比-80 ℃能耗更低，仪器设备需求更低。

图2 低温保护剂类型对G.lozoyensis Q1发酵的影响Fig.2 Effect of different types cryopreserve agents for fermentation of G.lozoyensis Q1

图3 冻存温度对生物量以及纽莫康定B0产量的影响Fig.3 Effect of frozen temperature on biomass and production

2.4 低温保护剂浓度优化

以10%甘油以及20% PEG-6000作为对照，进一步优化5%～10%甘油以及10%～20% PEG-6000两种保护剂混合物的合适配比。如图4所示，低温保藏后生物量与产量呈负相关，当生物量积累过多，产物合成减少，其中当生物量达到70 g/L时，产量仅为对照组的73.34%。结果显示8%甘油+20%PEG-6000的配比效果最佳，纽莫康定B0产量较单一组分低温保护剂对照组提高8.2%。

2.5 不同类型低温保护剂对G.LozoyensisQ1菌体形态的影响

丝状真菌作为工业生产中的重要微生物，形态学被认为是生产不同产品的关键参数之一，许多因素都能影响真菌的形态，诸如发酵培养过程中的搅拌速率和溶解氧等[14-15]。通常微生物在遇到如低温、过高或过低pH或者过高或过低温度等极端环境变化时，自身的菌体形态会出现一定的变化，由此可以反映菌体自身代谢是否出现变化。

本研究考察了不同类型低温保护剂对菌体形态产生的影响，结果如图5所示。未保藏菌株菌体表面呈现一定的褶皱，菌丝分叉多；8%甘油+20% PEG-6000两组保护剂保藏3个月后，菌体形态维持较好，仍保持一定褶皱；40%终浓度的蔗糖保藏3个月后菌体表面趋于光滑，与未保藏时的形态出现较大差异。从纽莫康定B0产量上来看，当菌体保藏过后菌丝形态能维持一定褶皱的实验组产量均能保持在1 g/L以上，但当表面趋于光滑时产量急剧下降，仅为初始的25%左右。

图5 低温保护剂在-80 ℃条件下对G. lozoyensis Q1菌体形态的影响Fig.5 Effect of cryopreserve agents for morphology of G. lozoyensis Q1 under -80 ℃A：未保藏种子液；B：40%蔗糖保藏；C：8%甘油+20% PEG-6000；D：未添加低温保护剂A:seed medium before freeing;B:cryopreserved with 40% sucrose;C：cryopreserved with 8% glycerol+20% PEG-6000; D：cryopreserved without cryopreserveagent

3 讨 论

在不同类型的低温保护剂条件下，当保护剂作用区域位于全细胞时，会对底物代谢能力造成一定损伤，但对G.lozoyensisQ1的发酵活力起到很好的保护作用，而当保护剂穿过细胞壁停留在细胞膜外时，对G.lozoyensisQ1的发酵活力以及底物的消耗能力均无法维持未保藏前的状态，而当保护剂作用于细胞壁外时，对G.lozoyensisQ1的发酵活力以及底物的消耗能力均能起到较好的保护作用。选用8%甘油 + 20% PEG-6000作为冷冻保护剂可实现G.lozoyensisQ1菌株在-80 ℃条件下的长期保存。10%甘油的冻存保护剂浓度在-20 ℃和-80 ℃条件下低温保藏3个月，纽莫康定B0产量未发生明显变化，可以在实际应用中使用-20 ℃进行短期保藏，相比-80 ℃能耗更低，仪器设备需求更低。

通过对比高产和低产保藏条件下菌丝形态发现，当菌体保藏过后菌丝形态能维持一定褶皱的实验组产量均能保持在1 g/L以上，当表面趋于光滑时产量急剧下降，仅为初始的25%左右。因此，可通过发酵前期观察菌丝形态预测发酵生产中纽莫康定B0的产量，为科研及工业化生产节约了时间及原料。

影响微生物存活和长期保藏的因素很多，深入研究和全面了解这些影响因素，做好菌种的保藏工作，可使菌种的优良特性得以保存。因此，菌种保藏一方面要根据微生物的生长、发育特征，尽量满足其生长条件，避免有害因素的影响；另一方面应尽量减少传代次数，以免引起菌株自发突变。此外，保藏的菌株应定期进行分离复壮[16]。

[1]Walsh T J, Pizzo A. Treatment of systemic fungal-infections-recent progress and current problems[J]. Eur J Clin Microbiol, 1988, 7(4): 460-475.

[2]Bills G F, Platas G, Pelaez F, et al. Reclassification of a pneumocandin-producing anamorph,Glarealozoyensisgen. et sp. nov., previously identified as Zalerion arboricola[J]. Mycol Res, 1999, 103: 179-192.

[3]Schwartz RE, Giacobbe R A, Bland J A, et al. L-671,329, A new antifungal agent.1. fermentation and isolation[J]. J Antibiot, 1989, 42(2): 163-167.

[4]宋萍, 章人川, 冯昆达, 等.Glarealozoyensis发酵生产棘白菌素类化合物纽莫康定的研究进展[J]. 中国抗生素杂志, 2015, 40(1): 6-12.

[5]Balkovec J M, Hughes D L, Masurekar P S, et al. Discovery and development of first in class antifungal caspofungin (CANCIDAS (R))-A case study[J]. Nat Prod Rep, 2014, 31(1): 15-34.

[6]Paterson R R M, Lima N. Biochemical mutagens affect the preservation of fungi and biodiversity estimations[J]. Appl Microbiol Biot, 2013, 97(1): 77-85.

[7]Crahay C, Declerk S, Colpaert J V, et al. Viability of ectomycorrhizal fungi following cryopreservation[J]. Fungal Biol-UK, 2013, 117(2): 103-111.

[8]Prakash O, Nimonkar Y, Shouche Y S. Practice and prospects of microbial preservation[J]. Fems Microbiol Lett, 2013, 339(1): 1-9.

[9]Hubalek Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms[J]. Cryobiology, 2003, 46(3): 205-229.

[10]Miyamoto-Shinohara Y, Sukenobe J, Imaizumi T, et al. Survival curves for microbial species stored by freeze-drying[J]. Cryobiology, 2006, 52(1): 27-32.

[11]Tao D L, Li P H. Classification of plant-cell cryoprotectants[J]. J Theor Biol, 1986, 123(3): 305-310.

[12]Meryman H T. Cryoprotective agents[J]. Cryobiology, 1971, 8(2): 173-183.

[13]Vekeman B, Hoefman S, De Vos P, et al. A generally applicable cryopreservation method for nitrite-oxidizing bacteria[J]. Syst Appl Microbiol, 2013, 36(8): 579-584.

[14]Pazouki M, Panda T. Understanding the morphology of fungi[J]. Bioprocess Eng, 2000, 22(2): 127-143.

[15]李晓静, 阳葵, 冯霞. 丝状微生物形态分析方法及影响形态的因素[J]. 化学工业与工程, 2002, 19(3): 233-237.

[16]汪世华, 彭利民, 周林峰, 等. 发酵工业染菌及其防止[J]. 发酵科技通讯, 2002, 31(4): 19-20.

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Effect of Different Cryopreservation Conditions on the Growth and Pneumocandin B0Yielding Capability ofGlarealozoyensis

QIN Ting-ting1, YUAN Kai1, WANG Xiao-ting2, SONG Ping1, HUANG He2

(1.Coll.ofBiotechnol. &Pharma.Engin.of, 2.Schl.ofPharma.Sci.of,NanjingTechUniversity,Nanjing211816)

Glarealozoyensisis pneumocandin B0(compound of echinocandin) producing strain, its variation was always observed during the continuous passage culture and fermentation that caused great assailment in scientific research and industrial production. Therefore, a cryopreservation was adopted for a long-term preservation ofG.lozoyensisQ1. A single factor experiment method was adopted to study on the effects of the types of cryoprotectant, the preservation temperature, the concentration of cryoprotectant on the thalamus form and the fermentation capability ofG.lozoyensisQ1. The results showed that with whole cell affecting 80 g/L glycerol and extra-cell wall affecting 200 g/L PEG-6000 as cryoprotectants, and stored at -80 ℃ for three months, the yield of pneumocandin B0was 1.6 g/L, basically accorded to that before the preservation. Moreover, after the preservation the form of hyphae of thalamus of experiment group could maintain a certain rimple, and maintained the production over 1 g/L. However, when the surface of the form of hyphae trend to be smooth, the yield was rapidly declined to only about 25% of the initial one. Therefore, glycerol with PEG-6000 as frozen protectants, could realize long-term preservation ofG.lozoyensisQ1 under the condition of -80 ℃.

Glarealozoyensis; pneumocandin B0; cryopreservation; hyphal morphology

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国家自然科学基金项目(21306084)

秦婷婷，女，硕士研究生。主要研究方向为微生物次级代谢产物的生物合成。Tel:025-58139942， E-mail：qtt@njtech.edu.cn

* 通讯作者。女，博士，助理研究员。主要从事微生物次级代谢产物的合成。Tel:025-58139942，E-mail：songping@njtech.edu.cn

2016-05-30；

2016-06-23

Q93

A

1005-7021(2017)02-0047-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.02.007