超声波介导质粒pET28a转化枯草芽胞杆菌的研究

王永刚 ， 魏清伟， 马雪青， 麻 慧， 孙尚琛， 冷非凡

(1.兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050；2.中国农业科学院 兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046；3. 兰州兰石能源装备工程研究院有限公司，甘肃 兰州 730000)

超声波介导质粒pET28a转化枯草芽胞杆菌的研究

王永刚1， 魏清伟1， 马雪青2， 麻 慧1， 孙尚琛3， 冷非凡1

(1.兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050；2.中国农业科学院 兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046；3. 兰州兰石能源装备工程研究院有限公司，甘肃 兰州 730000)

揭示超声波介导下质粒DNA转化枯草芽胞杆菌发生的生物学机制，以便于枯草芽胞杆菌基因工程菌株的工业化应用。建立超声波介导质粒pET28a转化枯草芽胞杆菌的一种方法，采用扫描电镜结合理化分析检测技术研究超声波处理前后细胞的变化。结果显示，一定条件的超声(40～100 W)处理后的质粒DNA可以转化枯草芽胞杆菌，处理后的细胞在电镜下表面凹凸不平，出现褶皱现象；而且胞内蛋白质、磷脂及碱性磷酸酶(AP)大量释放至胞外。结果表明，超声波介导的DNA转化是细胞生理响应与超声波共同作用的结果。

超声波；转化；生物学机制

外源DNA转化进入受体细胞是分子克隆的关键步骤，也是分子生物学发展的热点之一。目前，超声波介导的DNA转化方法主要被应用于革兰阴性菌中，Song等[1]首次采用超声波介导法成功将质粒DNA转化至革兰阴性菌PseudomonasputidaUWC1、EscherichiacoliDH5α和PseudomonusfluorescensSBW25中，而且P.putida的转化频率分别是电转化法的4倍、接合转化法的9倍[2]。革兰阳性菌B.subtilis具有质粒DNA复制能力强、原生质体制备与再生能力较强等特点，一直被作为一种模式生物应用于细胞融合研究。革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖层约为阴性菌的10倍，DNA较难发生转化。现阶段应用于枯草芽胞杆菌的转化方法主要有营养缺陷型突变株染色体DNA转化法[3]和电转化法等。在PEG诱导的外源DNA转化B.subtilis原生质体过程中，经一定条件的电压刺激后可以将转化效率由102cfu/μg DNA增加到103cfu/μg DNA。关于超声波介导下质粒转化枯草芽胞杆菌的新型技术尚不成熟。一定功率范围内的超声波在介导外源DNA高效转化宿主细胞的同时既能保持质粒DNA的完整性，又具有操作简便和转化效率高等优点。本研究参照超声波介导下质粒转化大肠埃希菌的方法[1]，将质粒pET28a转化枯草芽胞杆菌，研究了超声波处理前后细胞结构的变化及胞内生物大分子物质含量的变化，以期建立一种超声波介导的质粒DNA转化枯草芽胞杆菌的操作方法，初步探究DNA转化宿主细胞的生物学机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 枯草芽胞杆菌(本实验室分离保存)，质粒DNA pET28a(2.4 ng/mL)(兰州理工大学石油化工学院陈吉祥老师馈赠)。

1.1.2 试剂 胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂、氯化钙、卡那硫酸霉素、戊二醛、小牛血清蛋白(BSA)、二甲基甲酰胺(DMF)、1,6-二甲基-1,3,5-己三烯(DPH)、4-硝基苯磷酸二钠(PNPP)、质粒提取试剂盒(Sangon Biotech)等。

1.1.3 仪器 F97Pro13007型荧光分光光度计，上海棱光技术有限公司；UV-9200紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；AB104-N电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SHZ-82恒温振荡器，国华电器有限公司；Z36HK型高速冷冻离心机，德国哈默；KQ-250DB型数控超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；JSM-6701F型扫描电镜，日本电子光学公司。

1.2 方法

1.2.1 超声波介导质粒DNA转化枯草芽胞杆菌转化方法的建立 参照Song等[1]、王琨等[2]报道的超声波介导下质粒DNA转化大肠埃希菌的方法，建立枯草芽胞杆菌的转化方法，采用抗性筛选验证转化方法的可行性，并计算转化效率用以评价方法的实用性，同时通过0.7%琼脂糖凝胶电泳验证转化子的正确性。

1.2.2 扫描电镜观察超声波处理前后细菌细胞结构的变化 ①样品制备：取对数培养期的枯草芽胞杆菌悬浮液，3 000 r/min离心5 min，弃上清液。向细胞沉淀中加入菌体体积40倍的2.5%戊二醛混匀，使其成为悬浮液, 静置固定2 h；3 000 r/min离心5 min，沉降细菌，弃上清液；用蒸馏水重新悬浮菌体沉淀，再以 3 000 r/min离心5 min，弃上清液，重复3次，以清洗细菌；用梯度浓度(体积分数分别为50%、70%、80%、90%和95%)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15 min，再用100%的乙醇处理2次，每次20 min。最后用叔丁醇将菌体沉淀悬浮成浓度为105cfu/mL的细菌悬浮液。吸取悬液，滴在覆有盖玻片的样品台上，置于-10 ℃预冷的冷冻干燥机内进行真空干燥，待气压计指示10 Pa以下时取出样品待用[4-7]。②电镜观察：将以上干燥脱水后的枯草芽胞杆菌用镀膜仪，以10 Pa 的真空度，15 mA的离子电流镀金160 s并拍照。

1.2.3 超声波处理前后胞内大分子物质含量的变化 蛋白质、酶等大分子物质是维持细胞结构完整，保证细胞生理特性的物质基础。蛋白质含量测定采用Bradford法[8]，标准曲线y=3.485x+0.000 3，线性范围0～100 ng/μL，R2=0.999 6；参考Schlesinger等[9]在荧光分光光度计440 nm处测定磷脂含量；参考Waschuk等[10]在荧光分光光度计420 nm处测定碱性磷酸酯酶含量。

2 结果与分析

2.1 超声波介导质粒DNA转化枯草芽胞杆菌一般转化步骤

超声波介导质粒DNA转化枯草芽胞杆菌一般流程如图1所示。

图1 超声波介导DNA转化宿主示意图[1]

采用超声波(35 ℃、30 s、40 W)介导Pet28a转化，涂布于含有Kan的LB固体培养基上，转化子如图2。随机挑取平板中的单菌落至含有Kan的LB液体培养基中过夜培养后提取质粒DNA，0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图3所示，可以看出质粒条带单一，具有良好的完整性。图3中1为已知质粒DNA pET28a，2、3、4为从图2所示的平板中任意挑取的菌落提取质粒DNA后的电泳结果。电泳结果显示抗性平板中的菌落确为质粒DNA pET28a的阳性转化子，证明图1所示的转化步骤适用于质粒DNA对枯草芽胞杆菌的转化。

图2 超声波介导下pET28a转化枯草芽胞杆菌结果Fig.2 The result of plasmid pET28a transform for Bacillus subtilis induced by ultrasound

图3 质粒电泳结果图

2.2 扫描电镜下超声波处理前后细胞结构变化

图4A为未经超声波处理的枯草芽胞杆菌，细胞表面比较光滑，大小均匀，形态一致并且表面较暗；图4B为经过超声处理后的枯草芽胞杆菌，细胞表面出现很明显的褶皱，大小不一，细胞变得比较透明，相对未处理的细胞亮度较高。这可能是经过超声波处理后，细胞失水，胞内大分子物质(蛋白、磷脂等)释放导致细胞变得较松弛。

图4 超声处理前后枯草芽胞杆菌扫描电镜图Fig.4 The SEM images of Bacillus subtilis before and after ultrasonic treatmentA：未处理；B:处理A: Untreatment；B: Treatment

2.3 超声波处理前后大分子物质的变化

2.3.1 超声波介导质粒pET28a转化枯草芽胞杆菌方法的建立 在一定超声波范围处理下，测定处理前后细胞结构、胞内大分子物质(蛋白、磷脂、碱性磷酸酶)含量的变化验证超声波对细胞的影响，其实验参数优化：测量了5个处理组(a：未处理；b：35 ℃、30 s、40 W；c：35 ℃、30 s、100 W；d：35 ℃、120 s、40 W；e：30 ℃、120 s、100 W)。

2.3.2 不同超声波条件处理下枯草芽胞杆菌蛋白含量的测量 为研究超声波处理前后及不同超声波强度对宿主细胞B.subtilis细胞内容物的影响，取对数生长期的枯草芽胞杆菌菌液，5 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤3次后用蒸馏水悬浮。悬浮液按上述5组处理后离心取上清液，采用Bradford法测量了595 nm处未处理组及4个处理组下B.subtilis细胞蛋白质外漏情况，以此来评判超声波条件在转化过程中对宿主细胞结构的影响。结果见图5。

图5所示为经不同条件超声波处理后能够检测到的细胞液中蛋白质含量。由图5可知，未经超声波处理(a)的细胞在细胞液中能够检测到的蛋白质含量几乎为0，当超声波作用于Bacillussubtilis细胞时，细胞中的蛋白质开始向培养液中外漏，尤其当超声波的功率为100 W，超声时间为120 s时(e)，外漏向培养液中的蛋白含量明显多于其他处理组。半透过性与弹性是细菌细胞膜特有的性质，当超声波作用于细菌细胞时，细菌细胞内物质会因为细胞膜的半透过性的增大而流向细胞外，同时当超声波功率过大，超声作用时间过长时，细菌细胞壁也会受到一定程度的损害，导致能够检测到的细胞液中的蛋白质含量较处理条件温和实验组的略多。

图5 不同超声波条件处理下枯草芽胞杆菌蛋白含量Fig.5 Change of Bacillus subtilis protein content under different ultrasonic treatment

2.3.3 超声波处理前后磷脂含量的变化 磷脂作为一种含磷的脂质,是构成细胞生物膜的基本成分，在维持细胞膜流动性及细胞功能方面起重要作用。本实验研究了在超声波介导质粒pET28a转化Bacillussubtilis细胞过程中不同超声条件对宿主细胞Bacillussubtilis细胞膜中磷脂含量的影响。取待测样品200 μL加入浓度为0.5 mmol/L的1,6-二甲基-1,3,5-己三烯(DPH)溶液2 μL，再用100 mmol/L的氯化钙溶液稀释15倍后于黑暗下反应40 min。反应结束后于激发波长350 nm，发射波长440 nm下测量荧光值[9-11]。结果见图6。

图6 超声波处理前后磷脂含量的变化Fig.6 Change of Bacillus subtilis phospholipid before and after ultrasonic treatment

图6所示为经不同超声波条件处理的Bacillussubtilis细胞在荧光分光光度计下检测的细胞培养液中磷脂含量变化。由图6可知，未经超声波处理的(a)Bacillussubtilis细胞荧光值接近于0，即几乎无磷脂释放至培养液中。当对细胞给予超声波刺激时，细胞膜中的磷脂逐步释放至细胞液中，超声波条件越剧烈，释放至培养液中的磷脂含量越多。超声波作用于Bacillussubtili细胞时，超声波产生的气穴与声穴效应会对细胞膜产生压力，当细胞膜的弹性不足以抵抗这种外力时，其结构会被破坏，相应的细胞膜中的物质也被释放至胞外。在同一超声处理时间下，频率越大，细胞壁结构的改变越严重，胞内磷脂释放越多(b、c)；同理，在同一超声频率下，超声时间越长，对细胞壁的结构及细胞膜通透性改变越强，胞内磷脂释放越多(d、e)。

2.3.4 超声波处理前后碱性磷酸酶含量的变化 将过夜活化的枯草芽胞杆菌按1%的量接种至Tirs-葡萄糖培养基中，37 ℃振荡培养至对数生长期。细胞液于4 500 r/min下离心10 min后沉淀用无磷Tirs-葡萄糖培养基洗涤3次，沉淀于无磷Tirs-葡萄糖培养基中培养90 min(37 ℃)。取1.0 mL细胞处理液，加入2.0 mL 0.2%的4-硝基苯磷酸二钠(PNPP)溶液后于37 ℃下反应15 min，反应液呈黄色。反应结束后加入0.5 mL 13% K2HPO4终止反应，于420 nm处测量吸光值[9-11]。结果见图7。

图7 超声波处理前后碱性磷酸酶含量的变化Fig.7 Change of Bacillus subtilis AP before and after ultrasonic treatment

图7所示为分光光度计在420 nm处检测到的不同超声波处理条件下Bacillussubtilis细胞碱性磷酸酶释放至细胞培养液中的含量变化。不同超声条件处理下枯草芽胞杆菌碱性磷酸酶含量的变化趋势与蛋白含量、磷脂含量变化一致。随着超声波处理条件的愈加剧烈，释放至细胞外环境中的碱性磷酸酶逐步增多。当细菌细胞受到超声波冲击时，其细胞壁与细胞膜会受到破坏，细胞膜的通透性与流动性发生变化，细胞壁结构遭受到破坏，致使胞内物质大量流向胞外，故随着超声波条件的变化，能够检测到的碱性磷酸酶含量也逐渐变化。超声时间和频率显著影响细胞的完整性。

3 讨 论

尽管革兰阳性菌细胞壁相对革兰阴性菌较厚，但一定条件的超声波处理同样能改变阳性菌的细胞壁结构，改变细胞膜的通透性。本研究利用超声波成功地将质粒pET28a转化至枯草芽胞杆菌。对不同条件的超声处理下胞内外大分子物质的研究结果表明，超声波显著影响细胞膜的通透性，胞内外的大分子物质释放量随着处理时间与处理频率的变化呈现一定的规律性，这说明超声波对细胞及转化的影响是处理时间、处理频率等多因素综合引起的。电镜结果表明超声波产生的声学与气穴现象对细菌细胞结构影响显著，细胞因失水和胞内物质的释放导致细胞皱缩变形。

转化的发生是外界诱导和宿主细胞自身发生改变结合引起的。不论是化学诱导、电转还是超声波介导，Ca2+参与转化且为不可缺少的因素。关于Ca2+在转化中发挥的作用至今尚无明确的定论。依据本研究结果猜测：超声波处理后因为胞内外大分子物质的释放导致细胞壁及细胞膜变得较为松弛，Ca2+为DNA自身或是DNA-LPS复合物的进入打开了离子通道，方便其进入细胞内完成转化。

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Ultrasound Media-Induced Plasmid pET28a to TransformBacillussubtilis

WANG Yong-gang1, WEI Qing-wei1, MA Xue-qing2, MA Hui1, SUN Shang-chen3, LENG Fei-fan1

(1.Schl.ofSci. &Engin.,LanzhouUni.ofTechnol.,GansuLanzhou730050;2.ChineseAcad.ofAgric.Sci.,LanzhouVet.Res.Inst.,Lanzhou730046; 3.LanzhouLanShiEquip’tEngin.Res.Inst.Co.,LTD,Lanzhou730000)

The biological mechanism happened in the transformation ofBacillussubtilisunder media-induced plasmid DNA with ultrasound was revealed, in order to applyB.subtilisgenetic engineering strain industrially. A general method to media-induce plasmid pET28a and to transformB.subtilisultrasound was established, and studied the changes of cells adopting electronic microscope combined with physico-chemical analyses technologies before and after ultrasound treatment. The results showed that plasmid DNA after treated with a certain condition of ultrasound (40～100 W) could transformB.subtilis; after the treatment the surface of cells were ravelled and rimpled under the electron microscope; furthermore, a large amount of intracellular proteins, phospholipids, alkaline phosphatase and (AP) release to outside the cell. Therefore, media-induced DNA by ultrasound to transform is the results of combined action of cell physiological responses and ultrasound.

ultrasound; transformation; biological mechanism

国家自然科学基金项目(31460032)；兰州理工大学实验室管理处教学项目

王永刚 男，硕士，讲师。研究方向为微生物生理与遗传转化。E-mail:412316788@qq.com

2016-03-16；

2016-07-16

Q936

A

1005-7021(2017)02-0053-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.02.008