1株产α-糖苷酶抑制剂放线菌的筛选与鉴定

刘华松， 陈 羽， 戴伟巧， 陈一鸣， 赵晓云， 徐 威

(沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，辽宁 沈阳 110016)

1株产α-糖苷酶抑制剂放线菌的筛选与鉴定

刘华松， 陈 羽， 戴伟巧， 陈一鸣， 赵晓云， 徐 威*

(沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，辽宁 沈阳 110016)

利用酶的催化特性从520株土壤分离放线菌中筛选对α-淀粉酶和α-蔗糖酶均具有抑制作用的产α-糖苷酶抑制剂菌株，并对其进行菌株归属鉴定。试验结果表明：从土壤分离放线菌中筛选到对α-淀粉酶酶活力抑制率在75%以上的菌株45株，从这45株放线菌中筛选到1株对α-蔗糖酶抑制率在40%以上的菌株。通过对其进行形态学观察、生理生化特性鉴别，并结合16S rRNA基因序列分析，初步判定该菌株为天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolo。

α-淀粉酶；α-蔗糖酶；放线菌；抑制剂；鉴定

近年来，由于生活水平的提高、饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动多坐的生活方式等诸多因素导致全球糖尿病发病率增长迅速，糖尿病已成为继肿瘤、心脑血管病后的第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。流行病学研究表明，餐后血糖水平是引起糖尿病人群大血管并发症和微血管并发症的重要因素，这些并发症是引起糖尿病死亡率增大的一个主要原因。因此，严格控制餐后血糖对糖尿病的防治具有非常重要的意义。α-糖苷酶抑制剂可以直接延缓糖类物质在人体肠道内的消化吸收，且副作用少，目前已经成为越来越多科研工作者研究与开发新型安全高效降糖药物的热点之一[1-3]。放线菌是土壤中种类和数量庞大的微生物类群，具有强大的生物合成能力，一直以来都是人们筛选新型天然化合物的资源宝库。本研究利用酶的催化特性从土壤分离放线菌中筛选到1株对α-淀粉酶和α-蔗糖酶均具有抑制作用的菌株，并对其进行菌株归属鉴定，为进一步开发与现行药物(如阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇)作用机制不同的降糖药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 从辽宁、吉林、黑龙江、云南、陕西、江西等地土壤中分离放线菌520株(沈阳药科大学保藏)。

1.1.2 培养基 发酵培养基(g/L): 玉米淀粉75，牛肉膏20，蛋白胨7，K2HPO40.5，KH2PO42，MgSO4·7H2O 0.4，CaCO35，NaCl 1，pH 7.0。

1.1.3 试剂与溶液 ExTaq-DNA polymerase、DL2 000 marker(大连TaKaRa公司)，α-淀粉酶(上海碧莱清生物科技有限公司)，α-蔗糖酶(北京中泰天盟科技发展有限公司)，其他试剂均为国产分析纯；3,5-二硝基水杨酸溶液(g/L)：3,5-二硝基水杨酸6.3，重蒸酚5，亚硫酸钠5；磷钼酸溶液(g/L)：磷钼酸100；碱性铜试剂(g/L)：Na2CO325，NaHCO320，Na2SO4200，酒石酸钾钠200，CuSO4·5H2O 6。

1.2 方法

1.2.1 土壤放线菌代谢产物的制备 采用挖块法将520株放线菌分别接种至发酵培养基中(250 mL三角瓶装30 mL)，28 ℃、220 r/min连续培养7 d。发酵液于3 000 r/min离心10 min，收集上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，得发酵液滤液，备用。

1.2.2 α-淀粉酶抑制剂菌株的筛选 以0.75 U/mL的α-淀粉酶为母液，稀释成不同浓度(0、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 U/mL)的α-淀粉酶稀释液。取6支试管，分别加入0.2 mL不同浓度的α-淀粉酶稀释液，向各试管中加入0.2 mL蒸馏水和0.4 mL质量分数为2%的淀粉溶液，37 ℃恒温水浴保温5 min。加入0.8 mL 3,5-二硝基水杨酸溶液，在沸水浴中煮沸10 min，迅速冷却，加蒸馏水定容至80 mL。以0.2 mL蒸馏水为对照，在540 nm波长下测定吸光度。以酶活力为横坐标，以OD540为纵坐标，制作α-淀粉酶酶活力标准曲线。取0.2 mL发酵液滤液与0.2 mL 0.75 U/mL的α-淀粉酶液混合，再加入0.4 mL 质量分数2%淀粉溶液，37 ℃恒温水浴保温5 min。在试管中加入0.8 mL 3,5-二硝基水杨酸溶液，在沸水浴中煮沸10 min。迅速冷却，加蒸馏水定容至80 mL。以0.2 mL蒸馏水替代α-淀粉酶，其余步骤同上，作为对照。在540 nm波长下测定吸光度，从α-淀粉酶酶活力标准曲线上读出残存的酶活力，计算α-淀粉酶被抑制的百分率[4]。

α-淀粉酶抑制率(%)=((α-淀粉酶酶活力(蒸馏水组)-α-淀粉酶酶活力(发酵液组))/α-淀粉酶酶活力(蒸馏水组))×100%

1.2.3 α-蔗糖酶抑制剂菌株的筛选 以1.8 U/mL的α-蔗糖酶为母液，稀释成不同浓度(0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 U/mL)的α-蔗糖酶稀释液。取6支试管，分别加入0.1 mL不同浓度的α-蔗糖酶稀释液，向各试管中加入1.0 mL 蒸馏水和0.2 mL 质量分数2%淀粉溶液，35 ℃恒温水浴保温20 min。加入1.0 mL碱性铜试剂，在沸水浴中煮沸8 min。迅速冷却，加入磷钼酸试剂1.0 mL，摇匀，加蒸馏水定容至30 mL。以0.1 mL蒸馏水为对照，在650 nm波长下测定吸光度。以酶活力为横坐标，以OD650为纵坐标，制作α-蔗糖酶酶活力标准曲线。取0.2 mL发酵液滤液与0.1 mL 1.8 U/mL的α-蔗糖酶液混合，再加入0.8 mL蒸馏水、0.2 mL 质量分数为2%的蔗糖溶液，35 ℃恒温水浴保温20 min。加入1.0 mL碱性铜试剂，在沸水浴中煮沸8 min。迅速冷却，加入磷钼酸试剂1.0 mL，摇匀，加蒸馏水定容至30 mL。以 0.1 mL蒸馏水替代蔗糖酶溶液，其余步骤同上，作为对照。在650 nm波长下测定吸光度。从α-蔗糖酶酶活力标准曲线上读出残存的酶活力，计算α-蔗糖酶被抑制的百分率[5]。

α-蔗糖酶抑制率(%)=((α-蔗糖酶酶活力(蒸馏水组)-α-蔗糖酶酶活力(发酵液组))/α-蔗糖酶酶活力(蒸馏水组))×100%

1.2.4 产α-淀粉酶与α-蔗糖酶抑制剂菌株的鉴定 将筛选到的产α-淀粉酶与α-蔗糖酶抑制剂的菌株接种于国际链霉菌计划(ISP)所指定的7种培养基上，28 ℃恒温培养7 d，观察并记录基内菌丝和气生菌丝的生长状态及颜色、可溶性色素的有无及颜色；在高氏一号培养基上采用插片法观察放线菌孢子丝的形态；碳源利用试验与生理生化反应参照文献[6-7]；放线菌总DNA的提取参照文献[8] 。以总DNA为模板，采用细菌通用引物27F和1527R进行16S rRNA的PCR扩增。PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，51 ℃复性30 s，72 ℃延伸50 s，共30个循环；72 ℃延伸5 min。用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物后，送至金斯瑞生物技术有限公司进行序列测定。

2 结果与分析

2.1 α-淀粉酶抑制剂菌株的筛选

取6支试管，分别加入不同浓度的α-淀粉酶，以酶活力为横坐标，OD540为纵坐标，制作α-淀粉酶酶活力标准曲线，见图1。由图1可知，当α-淀粉酶酶活力在0～0.15 U范围内，酶活力与吸光度之间呈现良好的线性关系，其相关系数R2=0.999 6。对520株土壤分离放线菌代谢产物进行筛选，筛选到对α-淀粉酶酶活力具有抑制作用的菌株437株，占全部菌株的84.04%。对α-淀粉酶酶活力抑制率在75%以上的菌株45株，占其中的10.30%。其中，菌株7-1对α-淀粉酶酶活力抑制率最高，抑制率为85%。

图1 α-淀粉酶酶活力标准曲线Fig.1 Enzyme activity standard curve of α-amylase

2.2 α-蔗糖酶抑制剂菌株的筛选

取6支试管，分别加入不同浓度的α-蔗糖酶，以酶活力为横坐标，OD650值为纵坐标，制作α-蔗糖酶酶活力标准曲线，见图2。

由图2可知，当α-蔗糖酶酶活力在0～0.15 U范围内，酶活力与吸光度之间呈现良好的线性关系，其相关系数R2=0.999 2。对α-淀粉酶酶活力抑制率在75%以上的45株放线菌的代谢产物进行再次筛选，筛选到对α-蔗糖酶酶活力具有抑制作用的菌株10株，占其中的22.22%。对α-蔗糖酶酶活力抑制率在40%以上的菌株1株(菌株7-1)，占其中的2.22%。菌株7-1对α-蔗糖酶酶活力抑制率为41%。

图2 α-蔗糖酶酶活力标准曲线Fig.2 Enzyme activity standard curve of α-sucrose

2.3 产α-淀粉酶与α-蔗糖酶抑制剂菌株的生物学鉴定

菌株7-1采用插片法观察，孢子丝呈螺旋形。其在不同培养基上的培养特征见表1，生理生化反应特征见表2。

表1 菌株7-1在不同培养基上的生长特征

表2 菌株7-1生理生化特征

注：“+”为试验结果阳性或生长；“-”为试验结果阴性或不生长

利用 NCBI的Blast 软件将菌株7-1的16S rRNA(1 452 bp)序列与 GenBank中已报道的 16S rRNA 序列进行比较。试验结果表明：菌株7-1的16S rRNA序列与在GenBank中登记的多株链霉菌属的菌株具有高度同源性(99%)。结合其培养特征以及生理生化反应，初步确定该菌株为天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolor，其系统进化树见图3，该菌株可为开发与现行药物作用机制不同的降糖药物提供菌株资源。

图3 根据16S rRNA基因序列构建的菌株系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences

3 讨 论

α-糖苷酶抑制剂是目前临床治疗II型糖尿病的一线口服降糖药物，它通过可逆性抑制肠道内α-淀粉酶、α-蔗糖酶和α-麦芽糖酶等，可延缓多糖分解为单糖的过程，从而减慢葡萄糖的吸收速度，降低餐后血糖。目前用于临床糖尿病治疗的α-糖苷酶抑制剂代表性药物主要有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等。其中，阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制作用最强，对α-蔗糖酶和α-麦芽糖酶的抑制作用差。而伏格列波糖和米格列醇则恰好相反[9]。鉴于上述药物不同的作用机制，本研究利用酶的催化特性从520株土壤分离放线菌中筛选对α-淀粉酶和α-蔗糖酶均具有抑制作用的产α-糖苷酶抑制剂菌株，并对其进行归属鉴定。试验结果表明：从土壤分离放线菌中筛选到对α-淀粉酶酶活力抑制率在75%以上的菌株45株，从这45株放线菌代谢产物中筛选到一株对α-蔗糖酶抑制率在40%以上的菌株。该菌株在形态学、生理生化特性及16S rRNA序列上与天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolor比较相似，但也存在一定的差别(如淀粉水解试验呈阳性)，初步确定该菌株为天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolor。

[1]林珠灿，郭素华.中药多酚提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究[J].中国现代医药杂志，2011，13(2)：8-9.

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[3]吴莹，高慧，宋泽壁.知母盐制前后对α-葡萄糖苷酶抑制作用比较[J].医学研究杂志，2014，43(10)：40-42.

[4]雷凡，王月慧.测定稻谷中α-淀粉酶活性的两种方法比较[J].中国酿造，2014，23(11)：152-154.

[5]李有贵，钟石，吕志强，等.桑叶1-脱氧野尻霉素(DNJ)对α-蔗糖酶的抑制动力学研究[J].蚕业科学，2010，36(6)：885-888.

[6]丁栋，王博禅，陈桂琛，等.一株抗肿瘤放线菌的鉴定及生物活性[J].应用与环境生物学报，2012，18(6)：983-987.

[7]中国科学院微生物研究所放线菌分类组. 链霉菌鉴定手册[M]. 北京:科学出版社, 1975.

[8]徐平，李文均，徐丽华，等.微波法快速提取放线菌基因组DNA[J]. 微生物学通报，2003，30(4)：82-84.

[9]孟鹏，齐西珍，郑芳，等.α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用[J].微生物学报，2010，50(8)：1080-1086.

Screening and Characterization of an Actinomycete Strain Producing α-Glucosidase Inhibitor

LIU Hua-song, CHEN Yu, DAI Wei-qiao, CHEN Yi-ming, ZHAO Xiao-yun, XU Wei

(Schl.ofLifeSci.&Biopharm,ShenyangPharm.Univ.,Shenyang110016)

520 actinomycetes isolated from soil samples based on enzyme catalytic characteristic, a strain producing α-glucosidase inhibitor with α-amylase and α-sucrase as target was screened and identified to their belongings. It was found that 45 strains were obtained when the inhibitory rate of α-amylase was more than 75%. A strain from 45 strains screened above was selected with the inhibitory rate of α-sucrase more than 40%. According to morphological observation, physio-biochemical characterization and 16S rRNA sequence analysis, the strain 7-1 was initially judged to beStreptomycescoelicolor.

α-amylase; α-sucrase; actinomycetes; inhibitor; characterization

辽宁省教育厅高等学校创新团队项目(LT201423)；2015年辽宁省大学生创新创业训练计划项目

刘华松 女，硕士研究生。主要从事新型糖苷酶抑制剂的研究。Tel：024-23986409，E-mail：gzweishengwu@126.com

* 通讯作者。女，教授，硕士生导师。主要从事微生物制药及微生物转化合成生物活性物质的研究。Tel：024-23984216，E-mail：shxuwei8720@163.com

2016-04-11；

2016-05-05

Q93

A

1005-7021(2017)02-0058-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.02.009