贝母粗多糖的4种类型树脂纯化

张华，冉黄桥，杨能，颜复林，王亚坪，周浓

（重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆404000）

贝母粗多糖的4种类型树脂纯化

张华，冉黄桥，杨能，颜复林，王亚坪，周浓*

（重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆404000）

筛选出纯化效果最佳的树脂类型，以提高贝母粗多糖纯化效果。太白贝母和甘孜川贝母粗多糖提取液分别经过DA201-C型、AB-8型、201×4型、HPD600型共4种不同类型树脂静态吸附纯化后，比较其对贝母粗多糖提取液其核酸脱除率、蛋白脱除率，色素脱除率的影响，以及对多糖损失率和羟基自由基清除效果的影响。研究显示201×4型树脂对贝母粗多糖纯化效果最佳，核酸脱除率范围在92.22%～94.41%之间，蛋白脱除率在94.13%～94.95%之间，脱色素率在69.14%～86.07%之间，多糖损失率在62.13%～94.47%之间，羟基自由基清除效果在25.72%～29.82%之间。AB-8型树脂对贝母粗多糖纯化效果次之、其次是DA201-C型和HPD600型大孔树脂。201×4型树脂对贝母粗多糖纯化效果最佳。

太白贝母；甘孜川贝母；树脂；粗多糖；纯化

贝母是一种药食同源植物，属于百合科多年生草本植物。其具有镇咳、祛痰、平喘、镇静、镇痛、抗溃疡、抗血小板聚集、抗肿瘤等功效[1]。依据产地的不同，贝母可以分为川贝母、浙贝母、土贝母、伊贝母[2]。“太白贝母”属于川贝母项下，是川贝母入药重要基源之一。多糖作为近年来研究的热点之一。大量研究表明植物多糖具有抗衰老，等多种生物学功效，而且对机体几乎没有毒性，故对其生物学功效的研究愈来愈引起人们的重视[3]。贝母多糖提取纯化工艺相关研究也越来越多，但仍然处于起步阶段[4]。为了提高贝母多糖的品质，本试验着重研究经过不同类型树脂静态吸附纯化后，其对太白贝母粗多糖和甘孜川贝母粗多糖纯化效果的影响，以期待得到贝母多糖纯化效果最佳的树脂类型。

1 仪器、试剂与样品

1.1 仪器

722型可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；FA1004型号电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH.S精密恒温水浴锅：江苏金坛市医疗仪器厂；往复式水浴恒温摇床、zxfd-5250十段编程鼓风干燥箱：上海智城分析仪器有限公司；低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；FW80型高速试样粉碎机：河北省黄市新兴电器厂；旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；GDYQ-701S超声波清洗器：长春吉大小天鹅仪器有限公司。

1.2 试剂

乙醇（分析纯）、盐酸（分析纯）、氯仿、硫酸（分析纯）：重庆川东化工集团有限公司；氢氧化钠（分析纯）：四川西陇化工有限公司；30%过氧化氢（分析纯）、水杨酸（分析纯）、对照品为无水葡萄糖（批号20130701，供含量测定用）：成都市新都区木兰镇工业开发区；硫酸亚铁（分析纯）、正丁醇：成都市科龙化工试剂厂；蒽酮（分析纯）：中国试剂网；水为超纯水；抗坏血酸对照品（批号20150120，供含量测定用）：天津市福晨化学试剂厂；201×4型树脂：南开大学化工厂；DA201-C树脂：勤实科技；AB-8树脂、HPD600树脂：东鸿化工有限公司。

1.3 样品

太白贝母干燥颗粒样品：四川成都荷花池中药材市场；甘孜川贝母干燥颗粒样品：四川省南充市嘉陵区四川农货特产直销店。

2 方法

2.1 贝母样品预处理以及粗多糖的提取

将贝母干燥品粉碎，并过60目筛（0.280 mm）保存于干燥器备用。参见姜峻等报道的方法[5]进行贝母粗多糖提取。精确称取20.0 g贝母样品（粉末）加蒸馏水定容至200 mL，80℃水浴提取1 h，以3 800 r/min离心10 min，过滤取滤液。以上水浴提取步骤重复操作3次。将3次滤液合并，浓缩到原体积的1/3，趁热加入原浓缩液3倍～4倍体积的冷无水乙醇，之后放入4℃冰箱进行醇沉24 h。醇沉后取沉淀，加蒸馏水复溶，加入1/3倍体积Sevage试剂（氯仿∶正丁醇＝5∶1，体积比）振荡2 min，之后以3 000 r/min离心10 min，取粗多糖水溶液，定容至100 mL，于4℃保存备用。

2.2 不同类型树脂纯化贝母多糖溶液

不同树脂类型包括：DA201-C树脂、AB-8树脂，201×4型号树脂、HPD600树脂。

分别称取4 g树脂，用蒸馏水充分清洗以去除表面杂质，再用25 mL无水乙醇浸泡24 h，使树脂充分溶胀。之后弃去乙醇，用蒸馏水洗涤至无味，加20 mL 4%的HCl溶液浸泡3 h，再用蒸馏水洗涤至中性。再用20 mL 4%的NaOH溶液浸泡3 h之后，用蒸馏水洗涤至中性，最后加20 mL蒸馏水浸泡，保存4℃备用[6]。

2.3 贝母多糖树脂纯化效果指标检测

2.3.1 核酸脱除率

取样品原液和脱色后的样品溶液，分别在260 nm波长处测定其吸光度，计算其核酸脱除率。

式中：A0为样品原液吸光值；Au为样品脱色后吸光值。

2.3.2 蛋白质脱除率

取样品原液和脱色后的样品溶液，分别在280 nm波长处测定其吸光度，计算其蛋白质脱除率。

式中：A0为样品原液吸光值；Ap为样品脱色后吸光值。

2.3.3 色素脱除率

取样品原液和脱色后的样品溶液，在420 nm和470 nm波长处分别测定其吸光度，计算其脱色率。

式中：A0为样品原液吸光值；Ac为样品脱色后吸光值。

2.3.4 多糖损失率

葡萄糖标准曲线的制备：取0.10 mg/mL的葡萄糖标准溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL分别置于10 mL具塞试管中，蒸馏水补足至2 mL，将试管置入冰水中，沿试管壁加入蒽酮显色剂（0.2 g蒽酮/100 mL浓硫酸）5 mL后同时摇匀，再将试管放入沸水煮沸10 min取出，立即放入冰水中冷却5 min后在室温中平衡10 min。在620 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

多糖含量的测定[7]：将纯化前和纯化后贝母多糖溶液均稀释32倍，取分别稀释后的多糖样品溶液2mL，其他步骤同上。将该多糖溶液测定吸光值带入葡萄糖溶液标准曲线建立的方程，计算粗多糖含量。多糖损失率的公式如下：

式中：M1为纯化前多糖的质量，mg；M2为纯化后多糖的质量，mg。

2.3.5 羟基自由基清除率的测定（抗氧化活性测定）

在10mL比色管中依次加入6 mmol/L的硫酸亚铁水溶液1 mL，6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1 mL后，一定浓度多糖提取液1 mL加入比色管中，然后加入0.1%的H2O21 mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀后于37℃水浴30 min，测510 nm处的吸光度值A。按下式计算清除率[8]：

式中：A°为空白对照液的吸光值，即未加入贝母多糖溶液的吸光值；An为加入贝母多糖后的吸光值；An′为不加H2O2时的吸光值。

3 结果与分析

3.1 太白贝母粗多糖不同类型树脂纯化效果

不同类型树脂对太白贝母粗多糖纯化效果的影响见表1。

表1 不同类型树脂对太白贝母粗多糖纯化效果影响的结果（n=3）Table 1Purification effects of Taibai Fritillaria polysaccharide influenced by different types of resins（n=3）

由表1可知，不同类型树脂对太白贝母粗多糖纯化结果显示，核酸清除率范围在47.95%～92.22%之间，不同类型树脂存在着显著性差异，核酸清除效果由高到低的树脂类型顺序为201×4＞AB-8＞HPD600＞DA201-C型，其中201×4型树脂核酸清除效果最佳。蛋白清除率范围在55.75%～94.95%，蛋白清除效果最好的为201×4型，其次是HPD600型，AB-8型，DA201-C型。关于色素脱除率，在420 nm波长处色素脱除率范围在24.94%～69.14%之间，脱除效果最好的是201×4型和AB-8型树脂，两者之前不存在显著性差异；在470 nm波长处检测色素脱除率范围在30.38%～73.46%之间，脱除效果最佳的是201×4型树脂。由表1分析可知201×4型树脂清除核酸，蛋白，色素效果最佳。其次是AB-8型、HPD6000、DA201-C型。

此外，不同类型树脂对多糖损失率影响存在显著性差异，多糖损失率在35.94%～62.13%之间，其中损失率最高的是201×4型树脂，多糖损失率最低的是AB-8型和DA201-C型树脂（35.94%～38.78%，P＜0.05）。不同类型树脂对纯化后多糖溶液抗氧化活性（羟基自由基清除率）存在影响，多糖自由基清除率范围在12.46%～29.82%，其中抗氧化活性最高的是经过201×4型树脂纯化后的多糖。

总体上来看，201×4型树脂对太白贝母粗多糖纯化效果较好，但是多糖损失率也相对较高。如果从多糖损失率角度考虑，可以选择AB-8型树脂。

3.2 甘孜川贝母粗多糖不同种类树脂纯化效果

不同类型树脂对甘孜川贝母粗多糖纯化效果的影响见表2。

表2 不同类型树脂对甘孜川贝母粗多糖纯化效果影响的结果（n=3）Table 2Purification effects of Ganzi Fritillari polysaccharide influenced by different types of resins（n=3）

由表2可知，不同类型树脂对甘孜川贝母粗多糖纯化结果显示，核酸清除率范围在6.87%～94.41%之间，不同类型树脂核酸清除结果存在着显著性差异，核酸清除效果由高到低的树脂类型顺序为201×4型＞AB-8型＞DA201-C型＞HPD600型，其中201×4型树脂核酸清除效果最佳。蛋白清除率范围在8.89%～94.13%之间，蛋白清除效果最好的为201×4型树脂，其次是AB-8型和DA201-C型树脂，最差的是HPD600型树脂。关于色素脱除率，在420 nm波长处色素脱除率范围在19.08%～81.71%之间，脱除效果最好的是201×4型和AB-8型树脂，两者之前不存在显著性差异；在470 nm波长处检测色素脱除率范围在10.32%～86.07%之间，脱除效果最佳的是201×4型和AB-8型树脂。由表2分析可知201×4型树脂清除核酸，蛋白，色素效果最佳。其次是AB-8型、DA201-C型、HPD6000型树脂。

同时，不同类型树脂对多糖损失率影响也存在显著性差异，多糖损失率在43.71%～94.47%之间，其中损失率最高的是201×4型树脂（94.47%），多糖损失率较低的DA201-C型和AB-8型树脂（43.71%～44.41%）。不同类型树脂对纯化后多糖溶液抗氧化活性存在影响，多糖自由基清除率范围在8.96%～25.72%，其中抗氧化活性最高的是经过201×4型树脂纯化后的多糖。

总体来看，201×4型树脂纯化甘孜川贝粗多糖效果较好，但是甘孜川贝多糖损失率也相对较高。如果从避免多糖损失角度考虑，可以选择AB-8型树脂。

4 讨论与结论

本文选用了4种类型（DA201-C型、AB-8型、201×4型、HPD600型）的树脂纯化贝母粗多糖，201×4型树脂的纯化效果较好，但是多糖损失率较高，201×4型树脂属于阴离子交换树脂（属于强碱性），表明贝母粗多糖溶液的主要杂质带有阴离子基团，多糖也是含有阴离子基团。AB-8型树脂是一种球状、弱极性聚合物吸附剂。AB-8型树脂显示了对蛋白质的清除效果，原因可能是溶液中的大部分蛋白带有负电荷，带有疏水基团，以及有一定的极性，故带有弱极性的AB-8树脂吸附效果较好[9]。相比较而言，DA201-C型树脂纯化一般。DA201-C型树脂属于大网孔型非极性吸附树脂，其非极性不利于大分子蛋白以及核酸、色素等的脱除，但是其大网孔性依然可以起到一定的除杂效果。HPD600树脂属于极性类树脂，其对于贝母粗多糖的纯化效果较差，尤其是甘孜川贝母粗多糖的纯化效果最差，说明甘孜川贝母粗多糖杂质与太白贝母多糖多糖中杂质极性存在着明显差异，太白贝母粗多糖中杂质极性要高于川贝母粗多糖中杂质。可见贝母多糖基本呈现一定极性的高分子化合物。贝母多糖抗氧化活性测定结果均显示去除杂质越多的贝母粗多糖溶液，多糖羟基自由基清除率越高，表明多糖纯度的提高有利于贝母多糖抗氧化活性的提高。

综合以上研究结果显示，对于太白贝母粗多糖以及甘孜川贝母粗多糖201×4型树脂纯化效果较好。

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Crude Polysaccharide in Fritillaria Purified by Four Types of Resin

ZHANG Hua，RAN Huang-qiao，YANG Neng，YAN Fu-lin，WANG Ya-ping，ZHOU Nong*
（College of Life Science&Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000，China）

In order to enhance the purification efficiency of polysaccharide in Fritillaria（Beimu），the study tried to find out which type of resins was the best one for purification.Four different types（DA201-C，AB-8，201×4 and HPD600）of resin were studied.The nucleic acid removal rate，the protein removal rate，pigment removal rate，polysaccharide loss rate and the hydroxyl free radical scavenging effect were the index.The results showed that the type of 201×4 resin was the best one.Its nucleic acid removal rate，the protein removal rate，pigment removal rate，polysaccharide loss rate，the hydroxyl free radical scavenging effect was in the ranges of 92.22%-94.41%，94.13%-94.95%，69.14%-86.07%，62.13%-94.47%，and 25.72%-29.82%，respectively.The purification efficiency of AB-8 resin was the second one，followed by DA201-C and HPD600 resins. The type of 201×4 resin was the best one for purification of polysaccharide in Fritillaria.

Taibai Beimu；Ganzi Beimu；resin；crude polysaccharide；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.014

2017-01-02

重庆市基础科学与前沿技术研究计划项目（cstc2016jcyjA0555）；重庆市教委科学技术研究项目（KJ1501015）；重庆三峡学院引进高层次人员科研启动项目（14RC05）；重庆市教委科学技术研究项目（KJ1501025）；教育部“春晖计划”合作科研项目（Z2015150）

张华（1982—），女（汉），讲师，博士研究生，研究方向：食品营养与安全。

*通信作者：周浓，男，副教授，硕士。