HPLC法测定依折麦布辛伐他汀纳米粒中药物含量及包封率

邱永秀，石 雷，刘永丽，陈晓芳，金琳琳，赵音羽

（台州职业技术学院 化学制药研究所， 浙江 台州 318000）

HPLC法测定依折麦布辛伐他汀纳米粒中药物含量及包封率

邱永秀，石 雷，刘永丽，陈晓芳，金琳琳，赵音羽

（台州职业技术学院 化学制药研究所， 浙江 台州 318000）

建立了高效液相色谱法测定依折麦布辛伐他汀固体脂质纳米粒中药物含量及包封率。采用 Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈-0.025 mol/mL磷酸二氢钠水溶液（pH4.50）梯度洗脱，流速1 mL/min，检测波长分时段设置为234 nm或238 nm，柱温35 ℃；进样量20 μL；采用葡聚糖凝胶过滤法测定依折麦布辛伐他汀纳米粒包封率。结果表明，依折麦布在2.090～45.978 μg/mL浓度范围内线性关系良好（r=0.999 8），平均回收率为98.79%（RSD=1.11%）；辛伐他汀在2.182～48.013 μg/mL浓度范围内线性关系良好（r=0.999 8），平均回收率为99.56%（RSD=0.70%）；纳米粒胶体溶液中依折麦布的包封率为87.4%，辛伐他汀的包封率为83.1%。本方法简便、高效、准确，可用于依折麦布辛伐他汀纳米粒药物含量及包封率的测定。

依折麦布；辛伐他汀；固体脂质纳米粒；含量测定；包封率；高效液相色谱法

依折麦布为胆固醇吸收选择性抑制剂，作用于小肠黏膜 NPC1L1转运蛋白，抑制膳食和胆汁中的胆固醇跨小肠转运，降低总胆固醇和低密度脂蛋白[1,2]。辛伐他汀是一种 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，能够抑制体内胆固醇合成，使血浆中低密度脂蛋白和胆固醇浓度降低[3]。临床研究表明，依折麦布与辛伐他汀联合使用可对胆固醇吸收和合成产生双重抑制，增强血浆中胆固醇和低密度脂蛋白调节效果，减少不良反应发生；同时还有改善血管内皮功能、抑制血栓形成等作用[4-6]。依折麦布与辛伐他汀均为难溶性药物，口服不利于吸收，将两种药物制成复方固体脂质纳米粒，可提高药物水溶性，促进药物吸收[7]。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

依折麦布辛伐他汀固体脂质纳米粒胶体溶液（自制）；依折麦布对照品（湖北艺康源化工有限公司，含量 99.52%）；辛伐他汀对照品（浙江江北药业有限公司，含量99.2%）；葡聚糖凝胶（台州市四甲生化塑料厂，G50，100～200目）；乙腈为色谱纯；甲醇、磷酸二氢钠等均为分析纯。

BSA224S型电子天平；UV-1801型紫外可见分光光度计；Agilent 1220型高效液相色谱仪；RE-2000B型旋转蒸发器；KQ-250B型超声波清洗机。

1.2 检测波长确定

取适量依折麦布、辛伐他汀，分别加乙腈溶解，制备得到浓度约为 10 μg/mL的依折麦布溶液和辛伐他汀溶液，用紫外分光光度计在200～400 nm内进行扫描，结果见图1。由图1可知，依折麦布在234 nm处有最大吸收峰，辛伐他汀在238 nm处有最大吸收峰，故选择234 nm作为依折麦布的检测波长，238 nm作为辛伐他汀的检测波长。

图1 依折麦布和辛伐他汀UV扫描图Fig.1 UV scanning figure of ezetimibe and simvastation

1.3 色谱条件[8]

色谱柱：Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A相为乙腈，B相为0.025 mol/mL磷酸二氢钠水溶液（pH4.50）；梯度洗脱条件：0～11 min，A相维持50%，11～14 min，A相从50%线性改变至70%，14～24 min，A相维持70%，24～27 min，A相从70%线性改变至50%，27～35 min，A相维持50%；流速：1.0 mL/min；检测波长：0～11 min，维持234 nm，11～24 min，维持238 nm，24～35 min，维持234 nm；柱温：35℃；进样量：20 μL。

1.4 溶液制备

1.4.1 对照品溶液

精密称取依折麦布、辛伐他汀对照品适量，加流动相（A相和B相均为50%）溶解并稀释定容至100 mL，摇匀，配制成依折麦布104.5 μg/mL、辛伐他汀109.1 μg/mL的混合对照品储备液。

1.4.2 供试品溶液

取所制备的依折麦布辛伐他汀固体脂质纳米粒胶体溶液，精密吸取1.0 mL置10 mL容量瓶中，加无水甲醇稀释至刻度，超声10 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得依折麦布辛伐他汀固体脂质纳米粒破乳液。

1.4.3 空白纳米粒溶液

取所制备的不加药物的空白固体脂质纳米粒胶体溶液，按1.4.2节方法操作，即得空白固体脂质纳米粒破乳液。

1.5 葡聚糖凝胶过滤[9]

称取葡聚糖凝胶（G50）2.5 g，纯化水溶胀12 h以上，超声脱气，装于凝胶柱中（柱直径1 cm，柱高20 cm）。精密吸取依折麦布辛伐他汀固体脂质纳米粒胶体溶液 1.0 mL上柱，用脱气后的纯化水洗脱，流速1.0 mL/min，收集洗脱液18 mL，旋转蒸发至干，无水甲醇多次清洗旋蒸瓶，清洗液转入10 mL容量瓶中，加无水甲醇稀释至刻度，超声10 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得包封药物的破乳液。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性实验

分别取20 μL对照品溶液、供试品溶液和空白纳米粒溶液，按1.3节色谱条件测定，测定结果见图2。

图2 HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of standard solution, sample solution and blank solution

由图2可知，辅料与依折麦布、辛伐他汀分离良好，辅料对药物成分检测无干扰，依折麦布色谱峰保留时间约为8.9 min，辛伐他汀色谱峰保留时间约为21.1 min。依折麦布理论塔板数大于8 000，辛伐他汀理论塔板数大于30 000，与相邻色谱峰间分离度均大于2.0。

2.2 线性关系

精密吸取混合对照品储备液0.2，0.8，1.4，2.0，2.6，3.2，3.8，4.4 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用流动相（A相和B相均为50%）稀释至刻度，配制成一系列浓度梯度的溶液。按1.3节色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积A为纵坐标，以样品浓度C（μg/mL）为横坐标进行线性回归分析，得依折麦布回归方程为A = 50.576 C - 15.500（r = 0.9998），得辛伐他汀回归方程为A = 61.327 C - 18.648（r = 0.9998）。结果表明，依折麦布在 2.090～45.978 μg/mL内、辛伐他汀在2.182～48.013 μg/mL内线性关系良好。

2.3 检测限和定量限

精密吸取混合对照品储备液，按比例稀释，按1.3节色谱条件测定。信噪比为3∶1时，依折麦布检测限浓度为0.003 μg/mL，辛伐他汀检测限浓度为0.007 μg/mL；信噪比为10∶1时，依折麦布定量限浓度为0.012 μg/mL，辛伐他汀定量限浓度为0.031 μg/mL。

2.4 精密度实验

选取2.2节系列浓度梯度溶液中的一瓶，按1.3节色谱条件连续重复进样5次，记录峰面积，依折麦布、辛伐他汀峰面积的RSD分别为1.06%，0.53%，实验结果表明仪器精密度良好。

2.5 重复性实验

取同一批依折麦布辛伐他汀固体脂质纳米粒胶体溶液，按1.4.2节方法制备6份纳米粒破乳液，按1.3节色谱条件测定，依折麦布、辛伐他汀峰面积的RSD分别为1.89%，1.07%，实验结果表明本方法的重复性良好。

2.6 稳定性实验

取同一份供试品溶液，在0，1，2，4，6，8，10 h，按1.3节色谱条件测定，记录峰面积，依折麦布、辛伐他汀峰面积的RSD分别为1.21%，0.75%，实验结果表明10 h内供试品溶液稳定。

2.7 回收率实验

精密吸取混合对照品储备液 0.2，2.0，3.8 mL各3份，分别置于10 mL容量瓶中，用空白固体脂质纳米粒胶体溶液稀释至刻度，按1.4.2节方法制备纳米粒破乳液，按1.3节色谱条件测定，对回收率进行计算。结果依折麦布、辛伐他汀的平均回收率分别为98.79%，99.56%，RSD分别为1.11%，0.70%。

2.8 含量测定

取3批依折麦布辛伐他汀固体脂质纳米粒胶体溶液，按1.4.2节方法制备纳米粒破乳液，按1.3节色谱条件测定，通过峰面积计算药物含量，结果见表1。

表1 依折麦布辛伐他汀固体脂质纳米粒含量测定结果（n=3）Table 1 The contents of ezetimibe and simvastation nanoparticles(n=3)

2.9 包封率测定

取3批依折麦布辛伐他汀固体脂质纳米粒胶体溶液，按2.8节方法得到依折麦布的总含量C1总和辛伐他汀的总含量C2总。按 1.5节方法制备包封药物破乳液，按1.3节色谱条件测定，记录峰面积并计算依折麦布的包封药物含量C1包和辛伐他汀的包封药物含量C2包。计算依折麦布的包封率（包封率%=C1包/C1总×100%）和辛伐他汀的包封率（包封率%=C2包/C2总×100%）。结果，3批固体脂质纳米粒胶体溶液中依折麦布的包封率分别为87.6%，85.4%，89.3%；辛伐他汀的包封率分别为83.2%，84.1%，82.1%。

3 结 论

在实验中，参考文献做法[8,10]，对流动相组成和pH值、梯度洗脱条件、检测波长等进行了调整和优化，使得药物检测避免了卵磷脂等辅料的干扰，专属性强、准确度高，药物主峰峰形好，与杂质峰分离度好。通过包封率测定方法的尝试，选择了葡聚糖凝胶过滤法，该方法对设备要求低、操作简便、重复性好，较好的分离了包封药物和游离药物。

该研究建立了 HPLC法同时测定依折麦布辛伐他汀固体脂质纳米粒胶体溶液中两种药物含量的方法，通过葡聚糖凝胶过滤法对纳米粒胶体溶液中的包封药物和游离药物进行分离，并测定其包封率。本方法简便、高效、准确，为依折麦布辛伐他汀固体脂质纳米粒胶体溶液的质量控制提供了参考依据。

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Determination of Drug Content and Entrapment Efficiency of Ezetimibe and Simvastation Nanoparticles by HPLC

QIU Yong-xiu, SHI Lei, LIU Yong-li, CHEN Xiao-fan, JIN Lin-lin, ZHAO Yin-yu

（Chemical Pharmaceutical Research Institute, Taizhou Vocational & Technical College, Zhejiang Taizhou 318000, China）

The HPLC method was established to determine the drug content and encapsulation efficiency of ezetimibe and simvastation nanoparticles. Detection conditions were as follows: chromatographic column was Agilent SB-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm); mobile phase was acetonitrile and 0.025 mol/mL sodium dihydrogen phosphate solution (pH4.50) for gradient elution with the flow rate 1mL/min; the detection wavelength was 234 nm or 238 nm; the temperature of column was 35 ℃; the sample volume was 20 μL. The dextran gel filtration method was employed to isolate the nanoparticles for determination the encapsulation efficiency. The results showed that: the linear correlation was good (r=0.999 8) in the range of ezetimibe concentration 2.090～45.978 μg/ml, and the average recovery was 98.79% with RSD 1.11%; the linear correlation was good (r=0.999 8) in the range of simvastation concentration 2.182～48.013 μg/ml, and the average recovery was 99.56% with RSD 0.70%; and the encapsulation rates were 87.4% for ezetimibe, 83.1% for sivastation. The detection method is simple, efficient, accurate for determining drug content and encapsulation efficiency of ezetimibe and simvastation nanoparticles.

Ezetimibe; Simvastation; Solid lipid nanoparticles; Determination; Entrapment efficiency; HPLC

TQ 460.7；R 917

A

1671-0460（2017）04-0613-03

浙江省大学生科技创新活动计划，项目号：2015R462006；浙江省教育厅科研项目，项目号：Y201225666。

2017-02-14

邱永秀（1995-），女，江西省赣州市人，研究方向：从事药物新剂型新制剂研究。E-mail：qyx1377131217@163.com。

石雷（1978-），男，副教授，硕士，研究方向：从事药物新剂型新制剂研究。E-mail：sl_1026@126.com。