溶剂对石榴渣中黄酮的提取及抗氧化活性影响

祁冰洁, 赵秀红, 孙 丽

(1. 沈阳师范大学 粮食学院, 沈阳 110034; 2. 沈阳师范大学 计算机与数学基础教学部, 沈阳 110034)



食品与粮食

溶剂对石榴渣中黄酮的提取及抗氧化活性影响

祁冰洁1, 赵秀红1, 孙 丽2

(1. 沈阳师范大学 粮食学院, 沈阳 110034; 2. 沈阳师范大学 计算机与数学基础教学部, 沈阳 110034)

由于石榴产品的推广,石榴产品生产过程中生产的废弃物越来越多。其中石榴渣中的黄酮类物质具有抗氧化活性,可用于预防心脑血管疾病、阿尔兹海默症、帕金森病、肿瘤发生和提高免疫力。研究提取石榴渣中黄酮类物质的条件,为合理开发利用石榴渣副产物提供理论依据。采用改良的菲林法测定石榴渣中总酚含量,DPPH和ABTS方法进行抗氧化性测定,比较研究不同提取溶剂:石油醚、乙酸乙酯、100%丙酮、70%丙酮、100%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水对石榴渣中的黄酮提取物的提取率、总酚、总黄酮和抗氧化活性的影响。结果得出结论:利用70%乙醇溶液提取的石榴渣提取物具有最高的提取率、总酚、总黄酮和抗氧化活性。

石榴渣; 酚类; 黄酮类; 抗氧化性

0 引 言

石榴(PunicagranatumL.)属于石榴科(Pnuicaceae)石榴属(PunicaL.)植物原名安石榴,原产于伊朗、阿富汗等小亚细亚国家[1]。随着市场经济的发展,石榴的栽培面积不断扩大,产量呈明显的上升趋势。石榴加工的新产品如果汁、果酒层出不穷。但在产品规模不断扩大的同时,很多加工剩余废料被大量弃置。关于加工废料的利用在我国已不鲜见,例如我国东北地区的蓝莓,在汁液榨取之后,剩余部分被晾干制成蓝莓干。与其他水果不同的是,石榴渣滓中约有20%～30%为石榴籽,直接食用影响口感。大量研究表明,石榴渣中含有大量的黄酮类物质,具有显著的抗氧化活性。可用于预防心脑血管疾病和提高免疫力[1]。

在黄酮类物质的研究中,常采用醇类物质作为提取溶剂,根据研究表明,黄酮在甲醇中具有更好的提取效果[2]。然而在实际生产中,考虑到绿色环保安全生产的目的,一般不采用甲醇而采用乙醇作为提取溶剂。不同植物的种子和果实中,黄酮的种类和含量具有相对特异性。在石榴种子和果实中的黄酮高达 33种,含有9种花色苷、6种黄烷醇、1种黄烷酮苷、2种黄酮醇、3种黄酮醇苷、3种黄酮、5种黄酮苷和1种二氢黄酮醇苷[3]。根据相似相溶原理,不同提取溶剂对极性相同的黄酮具有较好的溶解能力。关于不同提取溶剂对石榴渣中黄酮类物质提取过程的影响还未有报道。在本研究中,根据不同极性选择不同的提取溶剂,对石榴渣中的总酚和总黄酮以及相关的抗氧化性进行了研究,进而为合理开发利用石榴渣副产物提供理论依据。

1 方法和材料

1.1 实验材料

石榴采购品种为新疆皮亚曼石榴,将石榴切开后榨汁,剩余的渣滓冷冻保存。

实验试剂:Folin-Ciocalteu试剂,DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl),ABTS[2,20-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid],trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid),均购自于Sigma Chemical Co. (Sigma Chemical Co.,St. Louis,American) 。没食子酸和芦丁采购自 TCI Co. (TCI Co.,Shanghai,China) 。蒸馏水、40%乙醇、70%乙醇、无水乙醇、70%丙酮、100%丙酮、石油醚、乙酸乙酯等有机试剂及盐酸、过硫酸钾、亚硝酸钠氯化铝均购买自中国国药集团Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd (Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd,Shanghai,China)。

1.2 提取方法

将榨取后的渣滓在50 ℃下24 h烘干,用粉碎机进一步研细并过筛(孔径0.25 mm),过筛后-20 ℃保存。称取20 g样品,加入200 mL提取溶剂超声40 min,将提取液以6 000 r/min的速度离心10 min,留取上清液旋蒸浓缩,并在50 ℃条件下完全蒸干得到提取物。

1.3 总酚和总黄酮测定

采用改良的菲林法测定石榴渣中总酚含量[4]。40 μL样品稀释溶液和等量25%菲林试剂充分混合,室温下经过5 min反应,向其中加入140 μL 700 mM碳酸钠溶液,避光反应40 min,在765 nm波长下测量其吸光度。用没食子酸做为标准品,总酚含量用每100 g样品中没食子酸当量表示(GAE/100 g样品)。

采用改良的盐酸-氯化铝法测定其中总黄酮的含量[5-7]。140 μL样品稀释溶液和8 μL 50 g/L亚硝酸钠溶液混合反应6 min,随后加入 8 μL 100 g/L 氯化铝溶液室温下反应5 min。接着向混合物中加入100 μL 40 g/L氢氧化钠溶液室温下反应30 min。在410 nm波长下测量其吸光度。采用芦丁做为标准品,总黄酮含量用每100 g样品中芦丁当量表示(RE/100 g样品)。

1.4 抗氧化性的测定

样品提取物的抗氧化性采用DPPH和ABTS方法进行测定,对照品为水溶性维生素E(trolox)。

DPPH检测方法[8-9]:将40 μL 1 mM DPPH甲醇溶液和10 μL提取物水溶液混合,混匀后加入190 μL甲醇避光反应30 min。517 nm波长下检测其吸光度。结果用样品浓度的EC50值表示。

ABTS检测方法[8,10]:室温下将7 mM ABTS 储备液和2.4 mM 过硫酸钾溶液等量混合反应12～16 h. 检测前将ABTS储备液用48倍甲醇稀释到吸光度为0.7±0.02,得到ABTS工作液。200 μL ABTS工作液与5 μL 样品稀释液混合30 ℃下避光反应5 min。734 nm波长下检测吸光度。结果用样品浓度的EC50值表示。

2 结果与讨论

2.1 不同提取溶剂的提取率

不同提取溶剂提取率的检测结果如图1所示,按照不同的溶液极性,选取了石油醚、乙酸乙酯、100%丙酮、70%丙酮、100%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水8种不同溶剂。结果显示70%和100%的乙醇溶液提取效果最好,分别为81.26%和79.76%。40%的乙醇溶液(74.58%)、70%丙酮溶液(74.17%)和水(67.22%)有所减少。而乙酸乙酯和石油醚的提取物为少量的油状物,质量忽略不计,推测主要是种子中的脂肪酸和油脂。

图1 不同溶剂的提取率Fig.1 Extracting rates of different solvents

通过比较发现,醇类比丙酮类具有更好的提取效果,根据Masturah Markom等人的报道[11],70%的丙酮的极性是6.5,70%的乙醇极性是7.1,50%乙醇的极性是7.9,而丙酮、乙醇和水的极性分别是5.4、5.6和9.0。依据相似相溶原理判断,石榴渣中的主要提取物的极性集中在6.5～7.9。通过对70%乙醇、40%乙醇和水溶液的比较发现,随着水比例的增加,溶剂的提取率在减小。通过比较70%和100%的乙醇发现,提取物中可能存在一定量的黄酮苷类物质。作为黄酮类物质的2个组成部分,黄酮和黄酮苷在乙醇中都具有较好的溶解性,但黄酮苷在水中的溶解度比黄酮高,因此推测70%和100%乙醇溶液间的差异是由少量的黄酮苷引起的。

2.2 总酚和总黄酮含量测定

图2 不同溶剂提取总酚含量Fig.2 Total amount ofphenolic compounds by different solvents

在我们研究的8种提取溶剂的总酚含量如图2所示,总酚结果由没食子当量(GAE)表示。70%的乙醇有最高的总酚含量(37.54 g GAE/100 g样品)。水(33.17 g GAE/100 g样品)、40%(33.18 g GAE/100 g样品)和100%乙醇溶液(31.99 g GAE/100 g样品)相对比70%(12.88 g GAE/100 g)和100%丙酮(23.66 g GAE/100 g样品)要高,在乙酸乙酯和石油醚中没有检测到总酚。

图3 不同溶剂提取总黄酮含量Fig.3 Total amount of flavonoids by different solvents

该8种溶剂提取总黄酮的结果如图3所示。经研究发现,总黄酮的结果比总酚要高,这是因为总黄酮与总酚的使用的标准品芦丁比没食子酸在单位质量的分子中所含的羟基数目要多。总黄酮的变化趋势与总酚相同,都是在70%(129.26 g RE/100 g样品)处最高,水(110.34 g RE/100 g样品),40%(113.30 g RE/100 g样品)和100%(113.68 g RE/100 g样品)乙醇溶液提取物比70%和100%丙酮提取物(92.19 g RE/100 g样品、37.63 g RE/100g样品)黄酮含量高。和总酚一样,研究发现乙酸乙酯和石油醚中也没有总黄酮的检测含量。

依据各个溶剂极性的变化顺序,从纯水到石油醚,最高的提取含量都集中在70%的乙醇上,说明在70%乙醇的作用下,能够获得最多的提取物,而且该提取物中主要成分是以黄酮类为代表的酚类物质。由表1可知,总黄酮/总酚的数值随乙醇的浓度增加而减小,说明低浓度乙醇提取物含有更多的非黄酮成分,且随水的比例增加而增加,进而说明非黄酮成分的酚类物质是易溶于水且水溶性较脂溶性好。就黄酮成分而言,黄酮类物质主要分黄酮苷元和黄酮苷两类物质,黄酮苷是在乙醇和水中都能溶解,而对应的黄酮苷元只能在乙醇中溶解不能在水中溶解,因此100%乙醇和水的差值近似等于黄酮苷所对应的黄酮的质量。排除这部分的黄酮就是具有黄酮结构而不具有黄酮苷的聚合物质。对于一般植物提取物来说,乙酸乙酯和石油醚主要用于提取其中酯类成分,在本次实验中乙酸乙酯和石油醚并未得到较高的提取率,说明在石榴种子中并未含有较多的油脂成分。

表1 总黄酮与总酚的相关性

2.3 抗氧化性测定

根据之前的研究,检测DPPH和ABTS自由基清除能力是评价抗氧化性的重要手段[12]。关于石榴渣提取物的抗氧化性评价直观反映了其相应的开发利用价值。关于抗氧化性的结果如图4所示。

图4 不同溶剂提取物对DPPH和ABTS自由基清除能力Fig.4 The ability of DPPH free radical and ABTS free radical clearance by different solvents

DPPH的EC50值变化范围从最低233.337 mg/L(70%乙醇提取物)到最高805.685 mg/L(100%丙酮提取物),而ABTS的变化范围从最低203.387 mg/L(70%乙醇提取物)到最高682.107 mg/L(100%丙酮提取物),二者的变化趋势相同。相对于标准品trolox,除了丙酮提取物之外,石榴渣提取物都具有较强的抗氧化性。与总酚和总黄酮变化相同的是,DPPH和ABTS表明70%乙醇提取物具有最强的抗氧化性。这说明总酚对抗氧化性有直接相关的作用,总黄酮作为总酚中重要的组成部分,这种作用尤其显著。这可能是和酚羟基的数目和位置有关。根据Balasundram等人[13]的报道,抗氧化性随着酚羟基的数目增多而增强。然而,在3-C和5-C位置的羟基具有更强的抗氧化作用。对于黄酮来说,由于结构更加复杂,影响抗氧化性的因素也就更多。例如和B环和C环相连的羟基更会影响物质的结构特性等。根据前人的报道,通常黄酮在种子和果皮中含量较多的物质为芦丁、槲皮素和儿茶素系列[14]。因此70%乙醇提取物具有最强的抗氧化性是因为其中含有的黄酮最多。另外值得注意的一点就是,在ABTS和DPPH检测结果的趋势变化中,40%乙醇提取物和水提取物之间高低顺序发生了变化。在DPPH检测中,40%乙醇提取物比水提取物略微高一些,而在ABTS中结果正好相反。推测这是由于在ABTS检测中,只有酚类与其发生反应清除自由基,而在DPPH检测中,依据其反应原理,DPPH自由基离子除了会和酚类反应之外,也会和碳水化合物比如多糖进行反应。而在40%的乙醇提取物中,由于受到乙醇的醇降作用,其多糖含量相对较少一些,因此DPPH结果显示水中自由基由于多糖物质的存在清除自由基效果更好,EC50值更低[14]。

3 结 论

研究了不同提取溶剂作用下,石榴渣中的酚类尤其是黄酮类成分的含量及其相应的抗氧化性。各组提取物由于其提取溶剂的极性不同,其相应的提取率、总酚和总黄酮都略有差异。基于实验结果推断70%乙醇提取物具有最高的提取率和突出的抗氧化性,其70%乙醇可以作为开发石榴渣的适宜提取溶剂。事实上,由于植物类天然提取物中多含有复杂的高聚合体,纯化出各个单体组分似乎具有较大的困难。因此在工业生产上,扩大提取纯化加工的规模的过程,往往涉及到一系列的技术问题。

本研究主要是为类似废弃提取物的开发利用提供了一种借鉴思路,通过总酚、总黄酮和抗氧化性相结合的方式综合评述其开发价值,这种活性和物质含量的相结合的方式也许更能说明植物总提取物比单一组分具有更强的实际食品生产价值。总而言之,这种结合方式能够相对合理地评估植物废弃物潜在的生物活性物质。

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Extraction of flavonoids and effects of solvents on flavonoids profiles and antioxidant activities of pomegranate pomace

QI Bingjie1, ZHAO Xiuhong1, SUN Li2

(1. Collegeof Grain Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China; 2. Department of Basic Computer and Math, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

This article investigated the potential ability of pomegranate pomace as a resource of phenolic compounds. Due to the pomegranate product extension,an increasing amount of pomace are residual waste in the process of production. The flavonoids from pomegranate pomace with antioxidant activity could be used to prevent cardiocerebrovascular disease,Alzheimer disease,Parkinson’s diseases and tumorigenesis and improve immunity. This article deals with the extraction conditions of flavonoids from pomegranate pomace, and provides the basic data for the exploitation of pomegranate pomace. The total phenols in the pomegranate was determined by modified Folin-Ciocalteu reagent,and the antioxidant capacity was tested by using DPPH and ABTS methods. The extractants which have different affinity with polar solvents were investigated, which was reflected by the extract yield and content of total phenols and flavonoids with antioxidants by different polar solvents such as petroleum ether, ethyl acetate,and 100% acetone, 70% acetone, 100% ethyl alcohol, 75% ethyl alcohol,50% ethyl alcohol with distilled water were also investigated. The results show that the extraction with the 70% ethanol solution gives out the most extraction yield and highs antioxidant activity.

pomegranate pomace; phenols; flavonoids; antioxidants

1673-5862(2017)02-0193-05

2016-12-17。

辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2015499,L2014436)。

祁冰洁(1964-),女(蒙古族),辽宁凌源人,沈阳师范大学副教授。

TS209

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2017.02.014