多烯磷脂酰胆碱对奥沙利铂联合氟尿嘧啶所致荷瘤裸鼠肝损伤的保护作用

徐盟，费倩，孟潇，李金娜，张天翔，王颖

（中国医科大学附属盛京医院肿瘤科，沈阳110022）

多烯磷脂酰胆碱对奥沙利铂联合氟尿嘧啶所致荷瘤裸鼠肝损伤的保护作用

徐盟，费倩，孟潇，李金娜，张天翔，王颖

（中国医科大学附属盛京医院肿瘤科，沈阳110022）

目的探讨多烯磷脂酰胆碱对奥沙利铂联合氟尿嘧啶所致肝损伤的保护作用。方法30只BALB/c裸鼠皮下种植结肠癌HCT116细胞制备荷瘤裸鼠模型，随机分为3组:肝损伤组，实验首日腹腔注射奥沙利铂（6 mg·kg-1·d-1）0.2 mL，同时连续7 d腹腔注射氟尿嘧啶（20 mg·kg-1·d-1）；多烯磷脂酰胆碱组，在给予等量氟尿嘧啶和奥沙利铂前30 min，腹腔注射多烯磷脂酰胆碱（85 mg·kg-1·d-1）0.2 mL，共7 d；荷瘤空白组，注射生理盐水作为对照。取各组裸鼠肝脏，石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察肝脏组织的变化；制作超薄切片，电子显微镜下观察肝细胞超微结构的变化；制作10%肝组织匀浆，黄嘌呤氧化酶法检测肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性，比色法检测过氧化氢酶（CAT）活性。结果肝损伤组裸鼠肝脏的胞质局部溶解，线粒体膜破损，细胞核膜水肿模糊，肝窦扩张，多烯磷脂酰胆碱部分逆转了这些损伤。与荷瘤空白组相比，肝损伤组SOD和CAT的表达明显降低（P＜0.05）；与肝损伤组相比，多烯磷脂酰胆碱组SOD和CAT的表达升高（P＜0.05）。说明多烯磷脂酰胆碱能减轻化疗药物对肝脏的毒性作用，抑制氧化应激反应。结论多烯磷脂酰胆碱对氟尿嘧啶联合奥沙利铂引起的肝损伤具有预防、保护作用，该作用可能与其膜修复和抗氧化应激反应的作用有关。

多烯磷脂酰胆碱；结肠癌；肝损伤；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶

有研究［1］报道，近四分之一的晚期结直肠癌患者在确诊时已经出现肝转移。目前对肝转移的有效治疗手段是新辅助化疗联合转移灶切除术［2］，因为化疗可以缩小肝转移灶，使原本失去手术机会的部分患者重新获得根治性切除的机会［3］，延长无瘤生存时间［4-5］。但是如果化疗时产生肝损伤，反而可能增加患者的围术期死亡率。化疗药物是很常见的导致肝损伤的因素之一，表现形式多样，常见的有奥沙利铂引起肝窦扩张，氟尿嘧啶引起炎症反应等［6-9］。本研究选取多烯磷脂酰胆碱作为主要研究药物，通过制备荷瘤裸鼠模型，观察经多烯磷脂酰胆碱干预后的肝脏组织形态和超微结构改变以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）的表达水平，从而为结直肠癌新辅助化疗中防止肝损伤提供用药依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

结肠癌HCT116细胞株（中科院上海细胞库提供）；1640液体培养基、胎牛血清、0.25%胰酶/胰蛋白酶液（美国Hyclone公司）；SOD、CAT蛋白定量试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；奥沙利铂注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司）；氟尿嘧啶注射液（上海旭东海普药业有限公司）；多烯磷脂酰胆碱注射液（赛诺菲制药有限公司）。

1.2 细胞培养与荷瘤裸鼠模型制备

采用含10%胎牛血清的1640培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温密闭培养箱内传代培养HCT116细胞。取对数生长期细胞，经0.25%胰酶消化制成细胞悬液，密度为1×107/mL。将裸鼠右腋窝处皮肤消毒，用1 mL注射器抽取0.2 mL细胞悬液于消毒部位皮下接种，SPF级饲养室继续喂养观察。30只裸鼠均于第5天出现肉眼可见的瘤块，第7天瘤块体积增长至约100 mm3。

1.3 实验动物分组与标本制备

采用随机对照实验方法，取荷瘤裸鼠30只，随机分为多烯磷脂酰胆碱组、肝损伤组、荷瘤空白组，每组10只。肝损伤组：实验首日腹腔注射奥沙利铂（6 mg·kg-1·d-1）0.2 mL，同时连续7 d腹腔注射氟尿嘧啶（20 mg·kg-1·d-1）；多烯磷脂酰胆碱组：在给予等量氟尿嘧啶和奥沙利铂前30 min，腹腔注射多烯磷脂酰胆碱（85 mg·kg-1·d-1）0.2 mL，共7 d；荷瘤空白组：腹腔注射生理盐水作对照。

给药结束后将各组裸鼠麻醉处死，迅速剔除裸鼠腹部体毛并用碘伏和75%乙醇做消毒处理，用无菌手术剪在裸鼠腹部做正中切口，并将皮肤向两侧分离以暴露腹腔，取出肝脏。每只裸鼠用眼科剪剪去肝组织约0.2 g，剪碎，加入0.86%冷生理盐水，用组织捣碎机以10 000 r/min上下研磨制成10%组织匀浆，离心留取上层清液，按试剂盒说明书加样后，用酶标仪测定SOD和CAT水平。每只裸鼠剪取肝组织2块，1块迅速浸入10%甲醛固定液中固定，石蜡包埋，切片，HE染色制成肝脏HE染色切片；1块立即置于2.5%戊二醛液中固定，1%锇酸后固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，切片，铀铅双重染色制成电镜超薄切片。分别在光学显微镜和电子显微镜下观察肝脏组织结构和肝细胞超微结构的变化。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 组织学观察结果

荷瘤裸鼠肝组织HE染色显示：给药结束后，荷瘤空白组裸鼠肝小叶结构完整清晰，未见肝窦扩张及炎症细胞浸润（图1A）；肝损伤组2例出现明显肝窦扩张（图1B）；多烯磷脂酰胆碱组9只裸鼠肝小叶结构完整清晰，未见肝窦扩张及肝细胞坏死等损伤表现，仅1例可见轻度肝窦扩张（图1C）。

2.2 肝细胞结构改变

图1 肝脏的组织学表现HE×100Fig.1 Pathology of liver samples HE×100

给药结束后，荷瘤空白组肝细胞核膜光滑，核仁清楚，胞质内有丰富的线粒体、粗面内质网（图2A）；肝损伤组肝细胞核型不规则，核膜局部水肿模糊，胞质局部溶解，线粒体外膜破损，粗面内质网轻度扩张（图2B）；多烯磷脂酰胆碱组肝细胞核膜光滑，胞质内有较多结构完整的线粒体，偶见线粒体外膜破损（图2C）。

2.3 肝脏组织SOD和CAT的表达结果

图2 肝脏的电镜超微结构表现铀铅双重染色×15 000Fig.2 Ultrastructure of liver samples Uranyl acetate and lead citrate staining×15 000

多烯磷脂酰胆碱组、肝损伤组、荷瘤空白组SOD表达水平分别为（1.76±0.36）、（1.44±0.31）、（2.45± 0.32）U/mg prot，CAT表达水平分别为（40.10±2.44）、（34.11±3.34）、（58.9±2.04）U/mg prot。与荷瘤空白组相比，肝损伤组SOD和CAT的表达明显降低（P＜0.05）；与肝损伤组相比，多烯磷脂酰胆碱组SOD和CAT的表达升高（P＜0.05）。证明了多烯磷脂酰胆碱能减轻化疗药物对肝脏的毒性作用，抑制肝脏氧化应激反应。

3 讨论

目前的肿瘤化疗研究通常采用裸鼠腋下注射肿瘤细胞制作荷瘤裸鼠模型，并在腹腔注射化疗药物来进行模拟。本研究采用的结肠癌荷瘤裸鼠是一个较好的用于研究防止奥沙利铂联合氟尿嘧啶导致肝损伤的动物模型。SOD和CAT是机体内2种主要的过氧化物酶，存在于各种组织和器官内，在肝脏中含量最高。在细胞膜被破坏、发生脂质过氧化反应时，SOD和CAT的活性明显增强。研究［10］表明，脂质过氧化反应是肝损伤的主要发生机制之一。它的原理是氧自由基产生过多，无法快速有效清除，逐渐堆积进而引起肝损伤。脂质过氧化反应发生时抗氧化酶活性增强，从而修复组织和细胞器的损伤，减轻氧化应激反应，发挥抗氧化作用［11］。目前有研究［12］表明多烯磷脂酰胆碱能增强CAT、SOD和谷胱甘肽还原酶的活性，加强受损细胞膜的修复，并对组织损伤有一定抗氧化治疗作用。本研究中，多烯磷脂酰胆碱组SOD和CAT的表达升高可以证实多烯磷脂酰胆碱能通过增强SOD和CAT活性，减轻化疗药物的毒性作用，抑制氧化应激反应，进而修复化疗性肝损伤。

越来越多的研究［6］发现，奥沙利铂为主的化疗可能导致肝窦梗阻综合征的发生。肝窦梗阻综合征是肝窦内皮细胞损害致肝窦流出道阻塞所引起的肝内窦型门静脉高压症，以门脉高压为主要表现，严重者可进展为肝衰竭。主要组织学改变包括肝窦扩张、肝内淤血坏死［7］。本研究的光镜结果证实了这一观点，同时通过多烯磷脂酰胆碱组与肝损伤组对照，也证实了多烯磷脂酰胆碱对奥沙利铂所致肝组织损伤的确具有一定保护作用。

多烯磷脂酰胆碱的主要活性成分是1，2二亚油酰磷脂酰胆碱，它与人体细胞膜的结构高度相似，能增加膜流动性。由于该药的这一特性，它常被用于保肝治疗，起修复肝细胞膜作用。但预防性用于化疗所致肝损伤中并不多见，也无统一的用药指导。本研究的肝脏超微结构观察结果证实了奥沙利铂联合氟尿嘧啶方案化疗可致膜结构明显损伤，也证实了多烯磷脂酰胆碱对化疗性肝损伤具有有效的保护作用。

总之，本研究从组织结构和蛋白分子水平阐明多烯磷脂酰胆碱通过抑制肝脏脂质过氧化反应、修复细胞膜、减轻肝窦内皮损伤，减少奥沙利铂联合氟尿嘧啶方案化疗所致肝损伤的发生。据此结果推测，在进行奥沙利铂联合氟尿嘧啶方案化疗的同时应用多烯磷脂酰胆碱，不失为一种安全、有效的保肝治疗方法。

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（编辑 陈姜）

Effects of Polyene Phosphatidylcholine on Hepatic Injury of Tumor-bearing Nude Mice Induced by Oxaliplatin and 5-fluorouracil Chemotherapy

XU Meng，FEI Qian，MENG Xiao，LI Jinna，ZHANG Tianxiang，WANG Ying

（Department of Oncology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110022，China）

Objective To study the protective effect of polyene phosphatidylcholine on hepatic injury induced by oxaliplatin and 5-fluorouracil.MethodsA subcutaneous tumor model was established by transplanting colocarcinoma HCT116 cells into 30 nude mice，which were randomized into three groups.The polyene phosphatidylcholine group was injected with polyene phosphatidylcholine（85 mg·kg-1·d-1）and 5-fluorouracil（20 mg·kg-1·d-1）for 7 days，and then injected with oxaliplatin（6 mg·kg-1·d-1）for 1 day.The hepatic injury group was injected with 5-fluorouracil（20 mg·kg-1·d-1）for 7 days and oxaliplatin（6 mg·kg-1·d-1）for 1 day.The tumor-bearing blank group was injected with normal saline.Hepatic injury was observed with ultrathin pathological sections.Liver homogenates were prepared to detect superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）activity.ResultsIn the hepatic injury group，pathological sections revealed dissolved cellular cytoplasm，mitochondrial membrane damage，cell membrane edema，and fuzzy，sinusoidal cell expansion.There were no obvious hepatic injuries observed in the polyene phosphatidylcholine group.The expression of SOD and CAT were lower in the hepatic injury and polyene phosphatidylcholine groups compared to the tumor-bearing blank group（P＜0.05）.The expression of SOD and CAT were higher in the polyene phosphatidylcholine group compared to the hepatic injury group（P＜0.05）.ConclusionPolyene phosphatidylcholine has a protective effect on hepatic injury induced by oxaliplatin and 5-fluorouracil，which may be related to its effect on membrane repair and inhibition of oxidative stress.

polyene phosphatidylcholine；colon cancer；hepatic injury；superoxide dismutase；catalase

R735.3

A

0258-4646（2017）06-0544-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.015

沈阳市科学技术计划（F13-316-1-69）

徐盟（1990-），女，硕士研究生.

王颖，E-mail：wang_ying@sj-hospital.org

2016-10-24

网络出版时间：