基于CRISPRCas/9基因编辑技术在HSV—1病毒感染疾病治疗中的应用sgRNA序列的设计

李昭君

【中圖分类号】R373 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2017）05-0-01

1.前言

在当今时代，对基因突变进行治疗，必须依靠基因编辑技术。CRISPR/Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第3代基因组编辑技术。该系统的核心由Cas9蛋白以及单链引导RNA（sgRNA）组成。CRISPR/Cas系统要发挥功能必须满足两个条件：一个是SgRNA与靶点DNA序列按照碱基互补原则配对；另一个是在与SgRNA配对的靶序列3'端必须紧跟PAM序列。CRISPR/Cas系统靶向新的靶点只需要合成新的SgRNA，操作简便，效率高，在基因编辑领域中被广泛应用。

2.实验目的

单纯孢疹病毒（HSV）的感染十分普遍，分为HSV-1和HSV-2，其中HSV-1是一种嗜神经病毒，主要引起生殖器以外的皮肤，粘膜和器官包括脑的感染。而HSV-1是一种DNA病毒，因此可以利用CRISPR Cas9尝试解决，从病毒的复制出发，剪切病毒DNA复制过程中的重要位点，可以达到抑制病毒复制的目的，这也为后来利用CRISPRCas9治疗其他更复杂危害性更大的病毒性疾病提供参考。

3.实验原理

3.1 CRISPRCAS/9原理

CRISPR/Cas9依赖于crRNA或sgRNA上的20个碱基的向导序列与目的DNA，以及PAM（NGG）序列决定切割位点的特异性。sgRNA的设计和选择是Crispr-Cas9技术的精髓，也是实验是否成功的关键一步。sgRNA决定了Cas9的靶向性和特异性[3]。对于目前广泛应用的土壤农杆菌系统来说：sgRNA序列的3‘端必须是NGG序列（例如：5′GTCACCTCCAATGACTAGGGNGG-3′），Cas9会在PAM序列5‘端大约3bp处对DNA序列进行切割。

3.2 sgRNA设计

3.2.1 设计原则

（1）对于sgRNA的长度，一般应为20nt左右；

（2）对于sgRNA序列的碱基组成，可选3'末端含GG的sgRNA，同时sgRNA种子序列尽量避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为40%～60%；

（3）sgRNA的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低。

另外SgRNA的活性与CRISPR系统的突变效率直接相关，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到有活性的靶点至关重要，通常在设计特异性靶点后，需要进行体外细胞活性筛选，筛选出有效的靶点用于后续实验。

3.2.2 靶序列的选择

根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI中进行查找，找到该基因CDS区[4]，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中，然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列。

4.实验步骤

4.1 CDS区域的选择

HSV-1基因组为152kb的线性双链DNA，在宿主细胞核内以级联反应的方式表达病毒蛋白。根据基因表达时序的不同，HSV-1基因可分为立即早期基因（IE）、早期基因（E）、和晚期基因。立即早期基因转录出现在病毒的DNA复制之前，立即早期基因转录后，激活随后的早期基因和晚期基因，引起病毒的复制及感染。

其中，ICP27蛋白就属于立即早期基因编码的蛋白之一[5]，在HSV-1生命周期的IE期产生，主要调节病毒和宿主细胞mRNA的合成与成熟，敲除ICP27可阻断HSV-1病毒的复制，是HSV-1复制必需的高保守蛋白，而且与其他孢疹病毒的基因产物存在较高的同源性。因此我们决定将Crispr的靶序列定位在编码ICP27蛋白的编码区（CDS区域）。

我们通过NCBI网站查找ICP27的编码区

（1）首先通过查找HSV-1之后查找ICP27蛋白

（2）在出现的搜索结果中选择HSV-1的ICP27蛋白，然后查看该结果

（3）在出现的HSV-1的ICP27蛋白的信息中选择CDS，单击，然后点击右下角的FASTA，最终得到ICP27蛋白的CDS区的碱基序列，根据ICP27蛋白的CDS区的碱基序列设计sgRNA。

4.2 目标序列选取

运行http：//crispr.mit.edu/网址，将编码ICP27蛋白的CDS序列分段输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中，然后进行设计运算，软件会按照分数由高到低自动输出目标序列，从中选取分数最高，脱靶最少的目标序列进行设计。通过比较分析，选出了一条得分最高99分，脱靶最少为4的最佳目标序列，即GATACTCGACGCCGCTCGCCCGG

4.3 合成sgRNA序列，构建表达载体

4.3.1 表达载体的构建

我们的标记基因将选用EGFP（增强绿色荧光蛋白），选择基因选用Puro（嘌呤霉素），以此来构建载体，将合成的sgRNA序列导入到质粒中，进而导入到细胞中，进行验证。

5.结语

CRISPR-Cas9设计简单、应用灵活、操作简便，在敲除细胞表面受体和切割病毒基因组、抑制病毒复制中有显著效果。因此下一步我们将验证我们所设计的SgRNA是否有效。可以说，在未来临床应用以及基因治疗中还有很长的一段路要走，比如提高Cas9编辑的准确性，避免脱靶现象出现等等。研究人员需要不断优化系统，降低脱靶效应，提高Cas9基因转导效率等。CRISPR-Cas9作为新的基因编辑技术，在慢性病毒感染或潜伏病毒感染疾病中具有巨大的潜在科学研究和临床治疗意义。