季德胜蛇药通过调控miR-335抑制肝癌Huh-7细胞增殖作用机制探讨

张玉 邵建国 陈琳 卞兆连 刁花玉 达坤林



季德胜蛇药通过调控miR-335抑制肝癌Huh-7细胞增殖作用机制探讨

张玉 邵建国 陈琳 卞兆连 刁花玉 达坤林

目的 探讨季德胜蛇药对肝癌Huh-7细胞增殖作用的影响并进一步从miRNA层面探讨其抑制增殖的调控机制。方法 以肝癌Huh-7细胞为模型，制备不同浓度的兔含药血清后培养Huh-7细胞，并同时设置相应浓度的对照组。CCK-8实验检测转染miR-335入Huh-7细胞后对该细胞增殖能力的影响；采用实时定量聚合酶链式反应qRT-PCR检测季德胜蛇药含药血清对Huh-7细胞中miR-335的调控作用；CCK-8实验检测季德胜蛇药含药血清对Huh-7细胞增殖能力的影响；Western-blot检测miR-335潜在靶向Bcl-w表达水平的变化。结果 miR-335过表达后CCK-8实验组与空白对照组及阴性对照组相比，其OD值显著降低(P<0.01)。含药血清干预下，与对照组相比，同等浓度的蛇药组miR-335表达水平较高，且在一定浓度范围内含药血清浓度越高，miR-335在Huh-7细胞中的表达也相继增高；此外，CCK-8实验下季德胜蛇药含药血清组都较正常血清组OD值低，且浓度越高，其OD值越低，都有较明显的统计学差异(P<0.01)。上调miR-335后，Huh-7细胞Bcl-w蛋白表达水平降低。结论 季德胜蛇药通过调控miR-335能抑制肝癌Huh-7细胞增殖。

季德胜蛇药； 人肝癌细胞； miR-335； Bcl-w

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球居第五位。目前HCC患者的5年生存率不到10%，死亡率位于各大恶性肿瘤第二位[1-2]。HCC确诊时已多属中、晚期，又由于肿瘤细胞的侵袭转移、凋亡逃避、血管生成以及肿瘤耐药等复杂的生物学行为也为HCC的根治带来一定的困难，预后极差[3-4]。因此，深入研究肿瘤在这些复杂生物学恶性表型形成中的信号传递及调节机制具有重要的理论和临床应用价值。季德胜蛇药片是中国特色中成药之一，能够清热解毒，活血化瘀止痛。目前主要用于治疗蛇虫咬伤，但近年来在临床实践中运用该药治疗肝癌也起到一定疗效。因此本研究旨在观察季德胜蛇药对肝癌Huh-7细胞增殖作用影响并进一步探讨该特色药对Huh-7细胞中miR-335表达水平及靶蛋白Bcl-w表达变化的影响，从转录后调控水平为该药的抗癌作用机制提供新视角，并为HCC发病机制及治疗方法提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

6只中国大耳白兔，体质量(3.0±0.5) kg，购于南通大学动物房(许可证号：SYXK(苏)2012-0031)；实验动物饲料：白兔基础饲料，购买于南通大学动物房，实验期间各组实验白兔均服用自来水，自由饮食。

1.2 人肝癌Huh-7细胞

购于美国模式培养物集存库(ATCC)，由上海交通大学附属仁济医院实验室保种培养并友情提供。

1.3 主要试剂与仪器

季德胜蛇药:购买于南通市第三人民医院，产于南通精华制药集团股份有限公司，药品批号：21150612。DMEM高糖完全培养基:立菲生物有限公司；胎牛血清：Invitrogen公司；胰蛋白酶：Invitrogen公司；Mimics:上海吉玛制药技术有限公司；CCK-8试剂：上海同仁有限公司；RT-PCR试剂盒：广州复能基因有限公司；Bcl-w抗体：武汉三鹰生物技术有限公司；蛋白抽提及浓度测定试剂盒：上海碧云天有限公司；GeneAmp PCR System 9700、CFX Connect Real-time System、RT-6000酶标仪(深圳雷桂生命科学有限公司)；紫外/可见分光光度计(岛津)；细胞培养箱(南通银河生物科技有限公司)；25 cm2培养瓶、6孔板、96孔板(Corning公司)。

1.4 兔含药血清的制备

大耳白兔6只，分为正常对照组和蛇药组。蛇药组给药剂量为1540 mg/(kg·d)，剂量为正常成人标准体重的10倍，每天相同时间灌胃1次，每天给药总容量为10 mL/kg；另对照组给予相同容量的生理盐水灌胃。连续灌胃7天，第8天禁食不禁水，于当天相同时刻灌胃4小时后心脏穿刺取血，分离兔血清。

1.5 Huh-7细胞的传代及培养

用含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃，5% CO2的培养箱中培养，待细胞密度长至95%左右时，加入适量的胰酶消化；待大部分细胞变圆时轻轻倒掉胰酶，加入5 mL完全培养基终止胰酶消化细胞，用无菌吸管吹打培养瓶的细胞面至细胞脱落。将上述细胞悬液分瓶，加入新的完全培养基后置入培养箱中继续培养。

1.6 CCK-8检测细胞增殖实验

将miR-335过表达入Huh-7细胞，分别铺于96孔板，每组设8个复孔，设空白调零孔，孔板周围予以PBS充填。每孔接种约4×103个细胞。细胞贴壁后分别于24小时，48小时，72小时取出一块96孔板，每孔加入10 μL CCK-8试剂及100 μL PBS，于2.5小时后在RT-6000酶标仪上选择450 nm波长检测其OD值。每组8个OD值，去除最大与最小值，其余6个值计算出平均值及方差。实验重复3次。

1.7 季德胜蛇药含药血清对肝癌Huh-7细胞中miR-335的调控作用

待肝癌Huh-7细胞生长至对数生长期，用胰蛋白酶消化后接种于6孔培养板中，培养12小时，待细胞贴壁后，设置各浓度含药血清及相应浓度的对照组血清，分别加入6孔培养板中，在细胞培养箱中继续培养48小时后，提取细胞RNA，qRT-PCR检测Huh-7细胞中miR-335的表达水平。

1.8 季德胜蛇药含药血清对肝癌Huh-7细胞增殖的影响

待肝癌细胞传至3～4代，生长状态良好时，用胰蛋白酶消化后进行光学显微镜计数，接种于96孔培养板中，每孔加入约4000个细胞，每组各8孔，加入含10%胎牛血清的培养基，每孔各150 μL，培养6小时待细胞贴壁后吸弃培养上清液，加入无血清的培养基100 μL，12小时后吸弃培养上清液，分别配制5%、10%、20%的含药血清(5%的含药血清配制方法即100 μL的总培养液中含5 μL的药物血清，依此类推)加入含药血清培养液。加药后分别于24小时、48小时、72小时取出一块96孔板，每孔加入10 μL CCK-8试剂及100 μL PBS，于2.5小时后在RT-6000酶标仪上选择450 nm波长检测其OD值。

1.9 Huh-7细胞Western-blot实验

miR-335过表达入Huh-7细胞培养48小时后弃去培养液，收集细胞蛋白。进行蛋白定量(BCA法)后加入1X上样缓冲液，制作SDS电泳胶，随后进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭和孵育抗体，化学发光、显影、定影，Photoshop进行蛋白图像的采集及后期处理检测靶蛋白Bcl-w的表达。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 miR-335转染效率

将miR-335过表达入Huh-7细胞，qRT-PCR检测Huh-7细胞中miR-335表达水平的变化，其实验组miR-335含量显著较空白对照组及阴性对照组升高，且差异具有统计学意义(P<0.01)，说明具有较高的转染效率。

2.2 CCK-8检测细胞增殖实验

结果发现miR-335过表达入Huh-7细胞后实验组与空白对照组及阴性对照组相比，其OD值显著降低，说明miR-335过表达能显著抑制Huh-7细胞增殖(P<0.01)。而空白对照组及阴性对照组两组之间差异无统计学意义。见表1。

表1 各组Huh-7细胞增殖实验不同时间段OD值变化比较

注： 与空白对照组比较，aP<0.01; 与阴性对照组比较，bP<0.01。

2.3 季德胜蛇药含药血清对肝癌Huh-7细胞中miR-335的调控作用

结果发现与对照组相比，5%及10%浓度的含药组miR-335表达水平较高，且在20%的浓度范围内含药血清浓度越高，miR-335在Huh-7细胞中的表达也相继增高。而不含药血清对照组之间miR-335表达水平变化不明显。见图1。

图1 不同浓度季德胜蛇药含药血清对肝癌细胞中miR-335的调控作用

2.4 季德胜蛇药含药血清对肝癌Huh-7细胞增殖的影响

结果发现在同一浓度下，同一时间点，季德胜蛇药含药血清组都较正常血清组其OD值低，除5%浓度48小时的OD值差异没有统计学意义，其他都有较明显的统计学差异。在同一时间点，不同浓度下，浓度越高，其OD值越低。见表2。说明季德胜蛇药含药血清能抑制肝癌Huh-7细胞增殖，且浓度越高对Huh-7细胞增殖抑制越明显。

2.5 Huh-7细胞Western-blot实验

在本研究中，通过转染技术在Huh-7细胞中高表达miR-335，随后Western-blot实验检测miR-335过表达入Huh-7细胞后其靶蛋白Bcl-w的表达情况，结果发现上调miR-335后，Huh-7细胞Bcl-w蛋白表达水平降低，表明miR-335可能是通过抑制其靶基因Bcl-w的表达来发挥对肝癌细胞凋亡调控作用。见图2。

表2 两组血清干预下Huh-7细胞增殖实验不同时间段OD值变化比较

注： 与同时段、同浓度正常血清相比，aP<0.05，bP<0.01。

图2 WB实验检测miR-335过表达入HuH-7细胞后靶蛋白Bcl-w的表达情况

3 讨论

季德胜蛇药片具有清热解毒、消肿止痛、活血化瘀、镇静排脓等作用，是一种传统的中成药，主要用于治疗蛇伤。它是国家级秘方,具体成分不祥，但所知的四种成分均有抗肿瘤作用。七叶一枝花有止血、抗肿瘤、细胞毒、抗炎、抗菌抑菌、镇静镇痛等多功能的生理作用[5]；蟾酥提取液可以诱导肝癌细胞走向凋亡[6]；蜈蚣提取液主要作用于癌症肿瘤血管，能帮助诱导肿瘤细胞坏死[7]；地锦草中的槲皮素成分能在肝肿瘤细胞和乙肝病毒中起到一定的抑制作用[8]。近年来它在诸多疾病的治疗中都起到了一定的疗效，其中关于季德胜蛇药治疗肝炎[9]、肝纤维化[10]乃至肝癌[11]相关的报导屡见不鲜，但其内在具体的调控机制却很少有报导。因此本实验将以miRNA表达水平为着眼点来探讨中医药治疗肝癌未来可能性的靶点。

miRNA是约19～24个核苷酸的非编码单链小分子RNA。最新研究发现，随着科学技术的进步，miRNAs在肝癌中的价值越来越引起人们的关注，它与肝癌细胞的增殖、分化、侵袭、凋亡密不可分。人们通过对不同临床分期、不同病理特征的肝癌miRNAs的研究，寻找出与肿瘤诊断、分期、疗效及预后相关的标志性miRNAs。如在肝脏最丰富的miRNA:miR-122[12]，能调节24种肝细胞中特定基因的表达水平并参与调节肝细胞成熟。miRNA在肝癌中还能调节细胞周期，如：miR-26a[13]直接通过针对D2和E2两个细胞周期蛋白诱导肝癌细胞周期阻滞。Bcl-w与多种肿瘤的发生及进展密不可分，如：肝癌、大肠癌、胆囊癌及胃癌等；在细胞凋亡的有关研究中Bcl-2被最早发现，它的成员都能调控并决定细胞凋亡过程[14-15]。Bcl-w基因对于Bcl-2家族中抗凋亡基因成员来说发现的较晚，是现在细胞凋亡研究的热点，分子组织学上与Bcl-2有较高的同源性。

大多数关于中医药能发挥其抑制癌细胞增殖等功能是通过中药及其有效成分调节编码蛋白的肿瘤相关基因的表达来实现的[16-17],并没有将miRNA当成中医药治疗肿瘤未来可能性的靶点。假设中医药通过调节miRNA靶基因相关的表达，使异常表达的miRNA基因趋向正常化，最终能够抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡等，起到防治肿瘤的效用。如果这种假说成立，那么所调控的miRNA可能是中药直接或间接调节的靶基因，因此，可以从miRNA水平揭示中医药防治肿瘤的调控机制。

本实验通过研究过表达miR-335入Huh-7细胞后，通过CCK-8实验来检测miR-335对细胞增殖能力的影响，结果发现miR-335过表达入Huh-7细胞后能显著抑制Huh-7细胞增殖，说明miR-335在肝癌中可能扮演一个抑癌因子的角色。通过qRT-PCR检测季德胜蛇药含药血清干预下肝癌Huh-7细胞中miR-335表达水平的变化，结果发现季德胜蛇药含药血清在一定浓度范围内浓度越高，miR-335在Huh-7细胞中的表达也相继增高。本研究中通过不同浓度的季德胜蛇药含药血清来干预肝癌Huh-7细胞后检测Huh-7细胞的增殖情况，结果发现季德胜蛇药含药血清能抑制肝癌Huh-7细胞增殖，且浓度越高对Huh-7细胞增殖抑制越明显。最后总结出季德胜蛇药含药血清通过调节miR-335能抑制肝癌Huh-7细胞增殖。在本研究中，笔者通过转染技术在Huh-7细胞中高表达miR-335，随后Western-blot实验检测miR-335过表达入Huh-7细胞后其靶蛋白Bcl-w的表达情况，结果发现上调miR-335后，Huh-7细胞Bcl-w蛋白表达水平降低，表明miR-335可能是通过抑制其靶基因Bcl-w的表达来发挥对肝癌细胞凋亡调控作用的。但目前实验尚存在某些不足之处：其一，含药血清对肝癌Huh-7细胞中miR-335的调控作用及增值影响只限定在20%的浓度范围内进行实验，而对20%的浓度之外的影响尚不知晓。其二，若能进一步实验探讨季德胜蛇药干预Huh-7细胞后其细胞Bcl-w的表达情况，得到的结论是Bcl-w表达降低，且浓度越高，降低的越明显，则更说明miR-335与Bcl-w可能是季德胜蛇药抑制细胞增殖的通路之一，因此有待后续实验进一步研究。

总之，季德胜蛇药含药血清通过调节miR-335能抑制肝癌Huh-7细胞增殖，进一步反映出miR-335将有望成为中药直接或间接调节的靶基因，从miRNA基因水平阐述中药作用的药效学物质基础，为中药防治肿瘤提供有效的分子靶点，且也为季德胜蛇药治疗肝癌提供一定的实验基础。

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(本文编辑： 禹佳)

Mechanism discussion ofJiDeShengSheyaoinhibiting liver cancer cell Huh-7 proliferation through regulating miR-335

ZHANGYu，SHAOJianguo，CHENLin，etal.

Thethirdpeople’sHospitalofNantong，Nantong226000,China

SHAOJianguo，E-mail:shaojianguo4144@163.com

Objective To discuss the mechanism ofJiDeShengSheyaoinhibiting liver cancer cell Huh-7 proliferation through regulating miRNA.Methods Cell Huh-7 were used as the model for study . Rabbits were given Jidesheng Sheyao by gastrogavage to prepare medicated serum. Then Huh-7 was cultured with medicated serum by different concentration. At the same time, the corresponding concentrations of the control group were set up. The effect of miR-335 on Huh-7 cells proliferation was tested by CCK-8 assay. QRT-PCR was used to detect the regulation function of miR - 335 on human liver cancer Huh-7 cell. The effect ofJideshengSheyaomedicated serum on Huh-7 cells proliferation was tested by CCK-8 assay. The effect of miR-335 on potential target protein Bcl-w was tested by Western-blot. Results The OD value of the experimental group was decreased significantly compared with blank control group and the negative control group by CCK-8 assay after up-regulation of miR-335 (P<0.01).The miR-335 expression level was higher compared with the control group in the same concentration of snake medicine group. In a certain concentration range, the expression of miR-335 in Huh-7 cells increased with increasing serum concentration; In addition, the OD value ofJiDeShengSheyaomedicated serum group were lower compared with normal serum, and the concentration were higher , its OD value were lower by CCK 8 experimental. They had also a significant statistical difference (P<0.01,P<0.001). After raising miR-335, the Bcl-w protein expression levels in Huh-7 cells were lower. ConclusionJiDeShengSheyaocan inhibite liver cancer Huh-7 cell proliferation through regulating miR-335.

JideshengSheyao； Huh-7； miR-335； Bcl-w

江苏省卫生厅面上项目(H201453)；南通市社会事业科技创新与示范计划(HS2014061)；2014年度江苏省南通市市级应用研究计划(BK2014073)；南通市科技局:新型临床诊疗技术攻关(MS22015105)

226000 南通市第三人民医院中医科(张玉、达坤林),肝病研究所(邵建国、陈琳、卞兆连、刁花玉)

张玉(1991- )，硕士，住院医师。研究方向:中西医结合消化内科。E-mail：1198963491@qq.com

邵建国(1965- )，博士，主任医师，教授。研究方向：消化系统疾病临床研究。E-mail:shaojianguo4144@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.04.015

2016-06-14)