紫鸭跖草总黄酮提取工艺优化及抗氧化研究

滕树锐，刘鹏飞，江 念，陈根洪，陈耀兵*

(1.湖北民族学院 林学园艺学院，湖北 恩施 445000；2.长江大学 动物科学学院，湖北 荆州 434023;3.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)



紫鸭跖草总黄酮提取工艺优化及抗氧化研究

滕树锐1，刘鹏飞2，江 念3，陈根洪3，陈耀兵1*

(1.湖北民族学院 林学园艺学院，湖北 恩施 445000；2.长江大学 动物科学学院，湖北 荆州 434023;3.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

以紫鸭跖草为研究材料，采用溶剂提取法对紫鸭跖草进行总黄酮的提取和体外抗氧化研究.经单因素和正交试验得出紫鸭跖草黄酮最佳提取工艺为：料液比1∶70，提取时间2 h，提取温度90 ℃，乙醇体积分数80%，在最佳提取工艺条件下黄酮得率为4.59%，该工艺稳定可行.紫鸭跖草黄酮对于试验中所选取的自由基在测定范围内，清除作用均随着质量浓度的增加呈现出正相关的效应，体现出较强的抗氧化作用；对DPPH自由基的清除能力较强并和相同质量浓度的VC清除效果基本相当，对羟自由基的清除作用在所试范围内效果弱于VC.

紫鸭跖草；总黄酮；提取工艺；抗氧化

鸭跖草科(Commelinaceae)植物生命力顽强，繁殖迅速且在我国分布广泛，在我国约有51种，遍布于我国各地，西南山区分布较多[1-2].紫鸭跖草(Tradescantiapallida)又叫紫露草[3-4]，为鸭跖草科紫叶鸭跖草属多年生草本植物.原本产于美洲墨西哥，现在全国各地都有栽培，现在已经成为重要的观赏植物[5].目前从植物中提取有效成分运用到医药、食品中也来越广泛[6-10]，黄酮类物质的抗溃疡、解痉、抗炎、抗衰老、抑菌及降血脂等生物活性也越来越受关注[11-13].目前对于鸭跖草科植物的活性成分研究主要集中在鸭跖草这一种上，对于该科中其他种类研究较少；紫鸭跖草主要作为观赏性植物进行栽培，对于其化学成分研究鲜有报道.紫鸭跖草生命力顽强，对环境适应性强且生长迅速，本文主要研究紫鸭跖草黄酮的提取工艺以及其体外抗氧化功能，旨在为紫鸭跖草的工业化开发提供理论依据，为天然抗氧化剂提供潜在资源.

1 材料与方法

1.1 材料

紫鸭跖草采自于湖北省恩施州恩施市湖北民族学院，由郑小江教授鉴定.

1.2 仪器

DZF-6090真空干燥箱(上海精宏设备有限公司)；TDL-80-2B 低俗台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；UVWIN5型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；FA-1004B电子天平(上海精密仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(上海安亭科学仪器厂).

1.3 试剂

主要试剂：亚硝酸钠、丙酮、氢氧化钠、甲醇、碳酸钠、无水乙醇 、芦丁标准品、硝酸铝(均为分析纯).

1.4 方法

1.4.1 材料预处理 取洗净的紫鸭跖草，置于烘箱中60℃烘干，取出粉碎，过60目筛，保存备用.

1.4.2 总黄酮提取及测定方法 采用溶剂提取法提取紫鸭跖草中的总黄酮，铝盐显色法测定黄酮的含量.

1.4.3 制作标准曲线方程 以芦丁为标准对照品.精确吸取0.8 mg/mL标准溶液5、4、3、2、1、0 mL，分别置于25 mL棕色容量瓶中，首先加1 mL质量分数为5% NaNO2，静置6 min，再加4 mL质量分数10%的硝酸铝，再静置4 min，最后加10 mL质量分数4% NaOH.摇匀后定容，静置35 min，510 nm测定吸光度值.y为吸光度，x为芦丁质量浓度，得到标准曲线方程：y=8.217 5x-0.057 1(R2=0.999 2).黄酮得率(%)=C×V×N/m×100，式中：C为测得样品溶液中黄酮的质量浓度(mg/mL)；V为样品溶液的最终稀释体积(mL)；N为稀释倍数；m为样品质量(mg).

1.4.4 溶剂选择 分别取烘干脱脂的紫鸭跖草材料粉末0.6 g，在料液比为1∶40，提取温度50 ℃，提取时间为1.0 h的条件下，分别用50%的甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、石油醚和蒸馏水提取，平行测定3次，取平均值，比较不同溶剂对提取液中黄酮质量浓度的影响，选择最适提取溶剂.

1.4.5 单因素实验 单因素试验设计，见表1.

表1 单因素试验设计

1.4.6 正交实验设计 在单因素确定的最佳范围内，选取4个梯度进行4因素4水平正交试验，正交实验设计见表2.

表2 正交实验因素水平表

1.4.7 抗氧化试验 紫鸭跖草→烘干→粉碎→石油醚脱脂→高体积分数乙醇提取→虑掉沉淀→取上清液→减压浓缩→50℃烘干至恒重，得紫鸭跖草黄酮粗纯物.以芦丁为标准品，经亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定烘干至恒重的黄酮粗纯物，得黄酮质量分数为81.44%.

1.4.7.1 DPPH自由基清除作用 参考文献[14]中的方法稍微改动，配置0.08 mmol/mL的DPPH乙醇溶液，总黄酮溶液按一定的质量浓度稀释，以VC做阳性对照.加入样品和DPPH溶液后，避光静置反应30 min，于波长517 nm处测定吸光值.做3次平行实验，取平均值.清除率计算式为：清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100,(A0为对照值，Ai为测定值，Aj为样品在体系中的吸光值).

1.4.7.2 对羟自由基的清除作用 参照文献[15]中的方法，在10 mL比色试管中按照顺序依次加入溶液：2 mL的10 mmol/L FeSO4，2 mL总黄酮溶液，2 mL的10 mmol/L的水杨酸溶液.摇匀后避光静置10 min，再加入8.8 mmol/L 的双氧水2 mL，在摇匀静置30 min后于波长510 nm处测其吸光度；做3次平行实验，取平均值.以VC为阳性对照，清除率计算公式为：清除率(%)=[D0-(Di-Dj)]/D0×100，(D0为对照值，Di为加样品测定值，Dj为样品在体系中的吸光值).

注：字母不同代表有显著性差异.图1 溶剂选择Fig.1 Solvent selection

2 结果与分析

2.1 溶剂选择

取紫鸭跖草粉末，在料液比为1∶40，提取温度50℃，提取时间为1.0 h的条件下，分别用50%的甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、石油醚和蒸馏水提取，测定三次，取平均值，计算黄酮得率，优选最佳提取溶剂.

由图1可知，在不同溶剂浸提条件下甲醇和乙醇总黄酮得率最高，和其它溶剂达到显著性差异(P<0.05)，且甲醇和乙醇之间差异不明显，考虑溶剂毒性问题，最佳浸提溶剂为乙醇.

2.2 料液比对总黄酮得率的影响

图2 料液比对黄酮得率的影响Fig.2 The effect of solid-feed liquid ratio on the yield of flavonoids

在温度、时间、溶剂相同的情况下，研究料液比对黄酮得率的影响，结果如图2所示.

由图2所得结果显示，料液比从1∶20到1∶60时，紫鸭跖草黄酮得率持续增长.当料液比超过1∶60后，黄酮得率呈现出缓慢下降趋势，说明在此料液比的情况下黄酮已经达到最佳溶解度，增加料液比让黄酮过度稀释难以检测，在生产中造成黄酮难以回收.故选择1∶60作为提取的最佳料液比，正交试验范围为：1∶50、1∶60、1∶70、1∶80.

图3 时间对黄酮得率的影响Fig.3 The effect of time on the yield of flavonoids

2.3 提取时间对总黄酮得率的影响

图4 温度对黄酮得率的影响Fig.4 The effect of temperature on the yield of flavonoids

在温度、料液比、溶剂相同的条件下，研究提取时间对紫鸭跖草总黄酮得率的影响，结果如图3所示.

由图3可见，在0.5～2.0 h紫鸭跖草黄酮得率明显增加，2.0 h以后黄酮含量缓慢下降.分析原因可能为样品中可溶性黄酮类物质在2.0 h处已溶解完全，继续增加时间使已经溶解的黄酮结构破坏 ，故选择2.0 h为最佳提取时间，正交试验范围为：1.5、2.0、2.5、3.0 h.

2.4 提取温度对总黄酮得率的影响

在时间、料液比、溶剂相同的条件下，研究提取温度对紫鸭跖草总黄酮得率的影响，结果如图4所示.

由图4可知，在70℃以内，温度越高，紫鸭跖草黄酮得率越高，原因可能是升高提取温度，加快了溶剂中的分子扩散速率，从而促进紫鸭跖草中黄酮类化合物的溶出.之后，再升高温度，黄酮得率上升不是很明显，且在90℃后黄酮得率具有显著下降趋势，推测其原因与黄酮类物质在高温条件下结构的破坏有关.故选择最佳提取温度为70℃，正交试验范围为：60、70、80、90℃.

2.5 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

在时间、料液比、温度相同的条件下，考察溶剂对紫鸭跖草总黄酮得率的影响，结果如图5所示.

图5 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig.5 The effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

从图5可得，乙醇体积分数在20%到80%范围内，总黄酮得率不断增大，当超过80%时，得率表现出显著下降的趋势，故选择80%乙醇作为最佳提取乙醇浓度，正交试验范围为：60%、70%、80%、90%.

2.6 正交试验

表3为正交试验结果表，表4为正交结果方差分析.经单因素确定范围后，由4因素4水平正交试验得出在所有因素中，对紫鸭跖草黄酮得率影响顺序为：D>C>A>B，紫鸭跖草黄酮最佳提取工艺组合为A3B2C4D3，即为：料液比1∶70，提取时间2 h，提取温度90℃，乙醇浓度80%.在试验因素中乙醇浓度与提取温度达到显著性差异.

表3 正交实验表

表4 方差分析

2.7 验证实验

精确称取紫鸭跖草1.0 g，在其最优化条件下(A3B2C4D3)提取5次，结果紫鸭跖草黄酮得率为4.46%、4.63%、4.57%、4.66%、4.61%，平均值为4.59%和正交项中A3B2C4D3的结果4.55%接近，说明优化后的工艺稳定可靠.

2.8 紫鸭跖草黄酮体外抗氧化试验

2.8.1 DPPH自由基清除能力 紫鸭跖草总黄酮对DPPH自由基的清除作用如图6所示，结果表明其总黄酮在低质量浓度下就有很好的清除DPPH自由基的能力，紫鸭跖草总黄酮对DPPH自由基的清除能力和相同质量浓度的VC基本相当，在所试浓度范围，紫鸭跖草总黄酮和 VC对DPPH自由基的清除率最高分别为 92.41%和95.23%.

2.8.2 羟自由基的清除效果 紫鸭跖草总黄酮对羟自由基的清除作用如图7所示，随着浓度的增加对羟自由基的清除作用逐渐增大，在所试范围内清除效果比VC弱，清除率达到26%后随着浓度的增加，清除效果变化不明显.

3 结论与讨论

本试验采用乙醇浸提法对紫鸭跖草黄酮进行提取，优化出紫鸭跖草黄酮最佳提取工艺为：料液比1∶70，提取时间2 h，提取温度90℃，乙醇浓度80%，在最佳提取工艺条件下黄酮得率为4.59%.罗开梅[16]对鸭跖草科中鸭跖草的黄酮提取工艺进行研究，在其优化的最佳提取条件下黄酮得率为3.43%，有一定的对比意义，总黄酮含量增加，和罗开梅提取3 h相比，提取时间明显缩短.

紫鸭跖草总黄酮对DPPH自由基和羟自由基有一定的清除作用，且随着剂量的增加清除作用逐渐递增，呈现良好的线性关系.在试验考察的剂量范围内对DPPH自由基的清除作用为92.41%，和VC基本相当.在考察的剂量范围内对羟自由基的清除率达到26%，弱于阳性对照VC.

虽然紫鸭跖草一直作为观赏植物，有一定的观赏价值，但是其总黄酮含量较高，作为提取黄酮制品的潜在资源，具有更高的药用和经济价值.另外，紫鸭跖草总黄酮具有一定的抗氧化功能，对DPPH自由基的清除作用和VC基本相当，作为天然的抗氧化剂也有一定的开发意义.

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责任编辑：高 山

Optimization of Extraction Technology and Antioxidant Activity ofTradescantiapallidaTotal Flavonoids

TENG Shurui1, LIU Pengfei2,JIANG Nian3,CHEN Genhong3,CHEN Yaobin1*

(1.School of Forestry and Horticulture，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China；2.College of Animal Science,Yangtze University, Jingzhou 434023，China ;3.College of Biological Sciences and Technology, Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China)

Tradescantiapallidawas used for research materials to extract flavonoids and study the antioxidative activity by solvent extraction method in this paper.We concluded that the optimum extraction technology of flavonoids inTradescantiapallidaby single factor test orthogonal design test as follows:feed liquid ratio 1∶70,extraction time 2 h,extraction temperature 90,ethanol concentration 80%,and under the optimum conditionsTradescantiapallidaextraction rate was 4.59%,and the process is stable and feasible.Flavonoids extracted fromTradescantiapallidahad scavenging effects on free radical that selected in the experiment within the range of measurement and the effects gradually increased with the increase of the concentration. They had stronger scavenging effects on DPPH free radical and the effects are almost equal to the same concentration of VC.They had weaker scavenging effects on hydroxyl redical than the same concentration of VC within the range of measurement.

Tradescantiapallida;flavonoids;extraction process;antioxidant

2017-03-21.

生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金项目(PKLHB1525、1526);恩施州技术研发项目(2013, 2014)

滕树锐(1991-)，男(苗族)，硕士生，主要从事野生植物资源保护与利用的研究;*

陈耀兵(1968-)，男，副教授，主要从事园艺植物方面的研究.

1008-8423(2017)02-0171-05

10.13501/j.cnki.42-1569/n.2017.06.014

Q949.95

A