DNA分子标记技术在玉米纯度检测中的应用研究

2017-06-22 17:18曲志伟
吉林农业·下半月 2017年6期
关键词:综述玉米

曲志伟

摘要:本文从常规鉴定、生化鉴定及分子标记技术鉴定等方面,阐述了玉米种子纯度鉴定的重要性。进一步对RAPD、RFLP、SSR和AFLP等分子标记技术在种子纯度鉴定和品种真实性分析中的应用潜力及存在问题进行比较,得出SSR分子标记技术是目前种子纯度和品种真实性鉴定中最适宜的技术。

关键词:DNA分子标记;玉米;纯度鉴定;综述

中图分类号: S513 文献标识码: A DOI编号: 10.14025/j.cnki.jlny.2017.12.024

种子纯度是保证优良品种增产潜力得以发挥的关键因素,因而品种纯度检验对保证种子质量具有重要意义。DNA分子标记技术是随着分子生物学的发展而发展起来的一种新型的种子纯度和真实性的鉴定方法,其具有简便、快速、准确等优点。本文介绍了4种分子标记技术的概念、原理及特点,并对每种标记技术在玉米自交系和杂交种纯度鉴定的应用进行了综述。认为SSR技术是目前玉米种子纯度检测较适宜的分子标记技术。

1研究意义

玉米是世界三大粮食作物之一,2012年我国玉米总产2.08亿吨,已经超过稻谷,成为第一大粮食作物,是世界第2大玉米生产国。2000年种子法颁布后,玉米的育种技术和生产经营逐渐向商业化转移,总体呈现“小、散、多”的趋势。然而玉米相较其他粮食作物而言利润较高,促使市场上出现了大量的套牌、冒牌的“假种子”,用没有通过审定的品种冒充审定品种,以及随意变更杂交种亲本,大大损害了农民的切身利益和品种权单位的利益。

种子的纯度直接决定着种子质量,其纯度的高低不仅对种子品质和生长状况有影响,对产量的影响也是不容忽视的。2012年我国玉米种植面积3500万公顷,如果所有种子纯度下降1%,那么全国玉米产量将减产75亿公斤左右,造成经济损失150亿元。可见,种子纯度直接影响到农业发展和农民增收。

2玉米种子纯度检测传统方法

2.1形态鉴别

2.1.1籽粒形态鉴别法 籽粒形态鉴别法主要是根据玉米的花粉直感、胚乳当代显隐性等遗传理论,由种子的外部形态、特征的差异来定论杂交种纯度。这种方法是主观的通过品种形态特征的区别来确定纯度。然而,品种之间形态差异略小,品种的形态特征会受生长环境和成熟度的影响。这样看来,籽粒形态鉴别法检测种子纯度的准确性不高,目前在种子纯度检测当中已很少使用。

2.1.2苗期标记性状法 苗期标记性状是指在作物的育苗期就能够明显识别的外观形态性状。例如叶色、叶形、花色、花冠、株型、开花期、角果等性状,具有较为直观易见的特点。这种纯度检测方法相对直观、简捷,具有其他检测方法无法比拟的优越性。目前我国在部分作物种子当中均有成功的案例。

2.2电泳鉴别法

电泳鉴别法主要是测定品种的同工酶或者蛋白质的差异,具有快速、准确、重复性好的特点。蛋白质是品种之间遗传差异的重要标志,也是电泳鉴别法测定玉米种子纯度的重要手段。然而同工酶具有组织或器官的差异性,酶的提取及电泳条件相对苛刻,在实际操作当中已经很少使用。

2.3分子标记测定法

我国育种骨干材料遗传基础狭窄,品种间性状区别不大,利用传统的方法很难准确有效的鉴别种子的纯度。DNA分子标记检测方法直接利用种子的DNA片段作为检测对象,能够检测到微小的差异,具有客观、准确、可靠、快速等特点。利用DNA分子标记可以解决这一难题。

2.4计算机智能识别技术

美国依阿华州立大学种子科学中心成功研发了品种鉴定的图像分析系统,预先将纯度较高的品种形态、电泳图谱输入到计算机分析系统,在种子纯度鉴定过程中将种子、幼苗、植株等信息输入系统后,可以得出种子的纯度。这种发达的纯度检测技术具有快速、准确等特点。然而,目前很少有针对该种方法的研究,数据库资源尚少,导致目前还没有切实开展推广应用,但自动化检测技术必定成为品种纯度检测的发展趋势,未来将有更大的发展空间。

3 DNA分子标记技术在玉米纯度检测中的应用

由于DNA分子标记技术具有环境稳定性、品种间变异可识别性、最小的品种内变异和实验结果的可靠性等优势,近几年广泛用于玉米种子纯度鉴定当中。DNA分子标记技术大致分为四种:

限制性片段长度多态性(Restriction Fragment;ength Polymorphism,简称RFLP)、随机扩增多态性DNA(Random AmplifiedPolymorphismDNA,简称RAPD)、扩增片段长度多态性(Amplification FragmentLength Polymorphism,简称AFLP)、在高等生物基因组合普片分布着由1~6个碱基组成的简单重复序列(Simple Sequence Re-peat,简称SSR)。

3.1 RFLP技术

1974年,“Grodz-icker”等人创立了一种以DNA-DNA杂交为基础较早发展起来的第一代遗传标记。该技术原理是把不同品种的DNA利用限制性内切酶酶切,之后产生了分子质量大小不同、长度不等的DNA片段,将大小不一的DNA片段用琼脂凝胶电泳分离,把凝胶中的DNA转移到尼龙膜上,将同位素标记的探针进行Southern杂交,随后便可观看到放射显影后的RFLP指纹,经与标准品种相比后方能得出目标品种的纯度。玉米种子存在较为丰富的限制性DNA片段长度的多态性,可作为玉米品种的DNA指纹鉴定。不过,这项技术成本昂贵、费时并且同位素具有放射性,对人体造成不良隐患,制约了实践当中的应用。

3.2 RAPD技术

1990年,美国杜邦公司的“Williams”联合加利福尼亚生物研究所的“Welsh”等人研发了RAPD分子标记技术。该技术提取不同品种的DNA,然后用随机引物进行PCR扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增产物后,比较胶上分子质量、大小不一的片段,来实现品种纯度鉴定。由于RAPD技术在种子纯度检测中具有多态、简便、省时、价廉等优势,广泛应用于品种纯度鉴定。在生产过程当中常用于鉴定新品种及拥有重要应用价值的玉米远缘种鉴定。

3.3 AFLP技术

1993年,荷兰科学家“Zabean”等人发明了该项技术,总体上使RFLP与RAPD的优点巧妙结合,兼具了纯度检测的稳定性和高效性。其原理是把不同品种的DNA利用限制性内切酶酶切后产生了分子质量大小不同、长度不等的DNA片段,将这些DNA片段用特定接头连接起来,再将接头与PCR引物末端的识别进行PCR扩增,最后由聚丙烯酰胺凝胶电泳把这些DNA限制性片段分离开,得出这些DNA片段的多态性,所得到的图谱即可鉴定种子的纯度。该技术在纯度检测当中具有多态的特点,然而巧妙的避免了复杂程序,并且具有较好的重复性。这项技术的弊端是,操作相对繁琐、步骤较多,无法快速鉴定出品种的纯度,对相关检测仪器设备的精准度要求较高,并且,该技术已被申请专利,无法得到普及与推广。

3.4 SSR技术

首先根据卫星区域特定序列设计成对引物,而后进行 PCR 扩增,由于不同个体间的核心序列串联重复数目明显不同,因而用PCR 方法扩增出长度不同的PCR产物,通过电泳检测,则可将不同个体间的SSR位点多态性显现出来,用SSR引物对检测样本的基因组DNA进行PCR扩增,能够获得多位点高分辨率的DNA指纹图谱,以此作为依据可进行种子纯度鉴定和真实性分析。SSR技术的多态性要优与RFLP技术的多态性,并且同时具有共显性、重复性、操作简单的优点。目前已得到很多专家、学者的研究,是目前玉米品种纯度鉴定领域中最为可靠的DNA分子标记技术。与其他分子标记技术相比较,SSR技术在玉米种子纯度检测上具有,精准度、多態性、重复性好等诸多优点,不过对设备仪器要求略高,程序相对复杂。

4 前景与展望

综上所述,4种DNA分子标记技术在纯度检测当中各有优势与缺陷。作物品种鉴别4大准则 “环境稳定性”、“品种间变异的可识别性”、“最小品种内变异”、“检测结果可靠性”,SSR技术是目前为止最符合作物品种鉴别四大基本准则的分子标记技术。SSR技术能较为客观、快速、准确的检测玉米品种的纯度和真实性,因此得到了大范围推广应用。

DNA分子标记技术是目前种业市场监管的重要支撑技术,对保障农民切身利益,维护种业市场质量安全起到了重要作用,相信在不远的将来会涌现更多的分子标记技术,并逐步得到完善。

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