干燥方法对白背毛木耳多糖抗氧化活性的影响

邱梦鸽，华丽君，汤怡，尹洁，李家祺，陈义勇

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

干燥方法对白背毛木耳多糖抗氧化活性的影响

邱梦鸽，华丽君，汤怡，尹洁，李家祺，陈义勇*

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

以白背毛木耳为原料，利用传统水提法提取白背毛木耳多糖（polysaccharides from Auricularia polytricha，APPs），分别对传统热风干燥多糖（APPs-H）、真空干燥多糖（APPs-V）和冷冻干燥多糖（APPs-F）的化学组成和抗氧化活性进行研究。结果表明，白背毛木耳多糖为含有少量的蛋白质的酸性多糖，不同干燥方法将会影响其单糖组成和糖醛酸含量。APPs-H，APPs-V和APPs-F具有较强的清除DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和亚硝基自由基的能力和还原力，在一定浓度范围内，多糖与抗氧化活性及还原能力之间呈正相关关系，干燥方法对白背毛木耳多糖抗氧化活性造成不同影响，其中APPs-F抗氧化活性最强，其次是APPs-V和APPs-H，冷冻干燥是制备APPs适宜的干燥方法。

干燥方法；白背毛木耳多糖；抗氧化活性

白背毛木耳（Auricularia polytricha）属于真菌门担子菌纲，银耳目黑木耳科黑木耳属[1]。目前国内外对白背毛木耳的研究主要集中在栽培技术方面，对白背毛木耳多糖（polysaccharides from Auricularia polytricha，APPs）的研究主要集中在提取和纯化[2-3]及生理活性如抗凝血、降血脂、增强免疫功能和抗肿瘤等作用[4]。

干燥作为多糖制备工艺过程中重要的一个环节，不同的干燥方式由于受热条件、传热方式及失水速度等因素可能会改变多糖的化学结构进而对多糖生物活性有显著的影响[5-6]。徐洲等[5]探讨了不同干燥方法对淫羊藿多糖化学性质和抗氧化活性的影响，程知庆等[6]研究了干燥方法对瘤背石磺多糖抗氧化性和还原力的影响，吴振等[7]研究了不同干燥方式对银耳多糖理化特性及抗氧化活性的影响，Fan Liuping等[8]研究了不同干燥方法对灵芝多糖抗氧化活性的影响，结果表明干燥方式对多糖的生物活性有显著的影响。不同干燥方法对白背毛木耳多糖抗氧化活性的影响研究还鲜见报道，因此本文研究了传统热风干燥、真空干燥和冷冻干燥这3种干燥方法对APPs的化学组成及抗氧化活性的影响，筛选出一种最适合APPs的干燥方法，旨在为APPs工业制备提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白背毛木耳：购于常熟市大润发超市；DPPH：上海楷洋生物技术有限公司；盐酸奈己二胺、对氨基苯磺酸：国药集团化学试剂有限公司；铁氰化钾：上海强顺化学试剂有限公司；无水乙醇、甲醇、丙酮、苯酚、硫酸亚铁、水杨酸、邻苯三酚、双氧水、Tris-HCl、VC、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、亚硝酸钠、溴化钾、正丁醇、氯仿、石油醚等以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HK-20B密封式粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司；DHG-9030A电热恒温鼓风干燥箱：上海三发科学仪器有限公司；CR22GⅡ高速冷冻离心机：日本HITACHI公司；SHB-B95循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器有限公司；Alpha 1-2 LD冷冻干燥机：德国CHRIST公司；722分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；HH-2智能数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；GC-14A气相色谱仪：日本Shimadzu公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的预处理

白背毛木耳干燥粉碎后用石油醚脱脂回流，再用95%乙醇洗涤2次，以除去一些色素、单糖、低聚糖和其他一些小分子物质，抽滤除去溶剂后，干燥得到脱脂后的白背毛木耳粉末样品备用。

1.3.2 APPs的提取

称取50g样品粉末于磨口锥形瓶中，加入2000mL蒸馏水，在恒温水浴80℃下提取4 h，将上清液离心15 min（4 000 r/min），上清液旋转蒸发浓缩，浓缩液采用sevage法去蛋白（6次），将浓缩液采用聚酰胺吸附柱层析法进一步纯化，用蒸馏水洗脱，得到洗脱液，洗脱液透析24 h，浓缩透析袋中液体，加入4倍体积95%乙醇，4℃过夜后离心（4000r/min），沉淀即为精制APPs。

1.3.3 APPs的干燥

采用传统热风干燥、真空干燥和冷冻干燥分别得到传统热风干燥多糖（Traditional hot-air drying APPs，APPs-H）、真空干燥多糖（Vacuuming drying APPs，APPs-V）和冷冻干燥多糖（Freezing drying APPs，APPs-F）。传统热风干燥干燥条件：温度50℃，风速2.0 m/s，干燥时间16 h。真空干燥干燥条件：温度50℃，真空度0.06 MPa，干燥时间12 h。冷冻干燥条件：温度-50℃，压力0.06 MPa，干燥时间24 h。

1.3.4 APPs化学组分分析

中性糖含量测定以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法[9]，蛋白质含量的测定以牛血清白蛋白为标准品，采用福林-酚法[10]，糖醛酸含量测定以半乳糖醛酸为标准品，采用间羟联苯法[11]。

1.3.5 APPs单糖组成

取多糖样品10 mg于具塞管中，加入2 mol/L的TFA溶液2 mL真空封管后于121℃水解1 h，水解液除尽过量的TFA后，真空干燥。采用糖腈乙酸酯衍生化法，加10 mg盐酸羟胺、适量肌醇（内标）和0.5 mL吡啶，90℃加热30 min后，取出冷却至室温，加入0.5 mL醋酸酐，90℃下继续反应30 min进行乙酰化，反应产物直接进行气相色谱分析。

色谱条件：采用OV1701弹性石英毛细管柱（Φ0.32 mm×30 m），载气为N2，流速1.5 mL/min，FID氢焰检测器，气化室温度260℃，检测器温度250℃，采用程序升温：起始温度150℃，停留1 min，以10℃/min升温至190℃，停留1 min，以3℃/min升温至240℃，停留20 min。

1.3.6 清除DPPH自由基的测定

参照Liu Lixiang等[12]方法进行，分别取2 mL不同质量浓度的多糖样品液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL），加入2 mL的0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，混匀后避光室温放置30 min，在517 nm波长处测定吸光度，记为A1；以蒸馏水代替多糖样液重复上述操作，在517 nm波长处测其吸光度，记为A0；以蒸馏水代替DPPH-乙醇溶液重复以上操作，作为对照管，在517 nm波长处测得吸光度，记为A2。VC作为阳性对照，代替多糖样品液同样进行测定，样品平行测定3次并且取平均值，按下式计算DPPH的清除率：

DPPH清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1表示加多糖样品的吸光度；A0表示不加多糖样品的空白组的吸光度；A2表示不加DPPH的对照组的吸光度。

1.3.7 清除羟基自由基的测定

根据Wang Hongyuan等[13]方法进行白背毛木耳粗多糖对羟基自由基的清除作用，在此基础上稍作修改。取不同浓度的多糖样液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL）各1.0 mL，分别加入硫酸亚铁（9.0 mmol/L）和1.0 mL水杨酸-乙醇（9.0 mmol/L），对照组以1.0 mL去离子水代替多糖样液，最后加1.0 mL过氧化氢溶液启动反应。将反应溶液在37℃恒温水浴30 min，在510 nm波长处测定吸光度，记为A1；以去离子水代替多糖样液来重复以上操作，在510 nm波长处测得吸光度，记为A0；以去离子水代替过氧化氢溶液重复上述操作，在510nm波长处测其吸光度，记为A2。3种样品分别测定，VC作为阳性对照，代替多糖样品液同样进行测定，样品平行测定3次取平均值，按下式计算·OH的清除率：

·OH清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1表示加多糖样品的吸光度；A2表示不加多糖样品的空白组的吸光度；A0表示不加过氧化氢的对照组的吸光度。

1.3.8 清除超氧阴离子自由基的测定

参照Jiang Bo等[14]方法并略有修改，取4.5 mL的Tris-Hcl缓冲液（50 mmol/L，pH8.2）在25℃恒温水浴20 min后，加入1.0 mL不同质量浓度的多糖样品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL）和0.4 mL邻苯三酚溶液（25 mmol/L，25℃水浴预热）混匀，在25℃水浴5 min，再加入1.0 mL抗坏血酸（8 mmol/L）终止反应，迅速在420 nm波长处测定吸光度，记为Ai；以蒸馏水代替多糖样液来重复以上操作，在420 nm波长处测得吸光度，记为A0。VC作为阳性对照，代替多糖样品液同样进行测定，样品分别平行测定3次取平均值，按下式计算O2-·清除率：

O2-·清除率/%=（A0-Ai）/A0×100

式中：A0表示不加多糖样品空白组的吸光度；Ai表示加多糖样品的吸光度。

1.3.9 清除亚硝基自由基的测定

参照文献[15]略有修改，取2.0 mL的NaNO2（5mg/ L）和3.0 mL不同质量浓度的多糖样品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL）常温反应30 min后，再加入质量分数为4%的对氨基苯磺酸溶液1.0 mL，摇匀静置5 min后，再加入质量分数为0.2%盐酸萘乙二胺0.5 mL，混合均匀静置15 min，在538 nm波长处测得吸光度，记为A1；以去离子水代替多糖样液来重复以上操作，在538 nm波长处测得吸光度，记为A0；以去离子水代替NaNO2重复以上操作，在538 nm波长处测得吸光度，记为A2。VC作为阳性对照，代替多糖样品液进行测定，样品分别平行测定3次取平均值，按下式计算NO2-自由基的清除率：

NO2-自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1表示加多糖样品的吸光度；A0表示不加多糖样品空白组的吸光度；A2表示加多糖样品，不加NaNO2的吸光度。

1.3.10 还原力的测定

参照Wu Huichun等[16]的方法，在具塞比色管中分别加入2 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L、pH6.6）、0.2 mL不同质量浓度的APPs-H、APPs-V和APPs-F多糖样品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL）和质量分数为1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，混合均匀，50℃恒温水浴20 min后，加入质量分数为10%的三氯乙酸2.5 mL终止反应。取反应溶液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL FeCl3，混合均匀静置10 min，4 500 r/min离心10 min，在700 nm波长处测吸光度，VC作为阳性对照，样品平行测3次取平均值。

1.3.11 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 APPs化学组分

不同干燥方法得到的APPs化学组成见表1。

表1 不同干燥方法的APPs化学组成Table 1 Chemical composition of APPs dried by different methods %

从表1可以看出，3种APPs均含有中性糖、糖醛酸及少量的蛋白质，说明3种多糖是酸性多糖，APPs-H、APPs-V和APPs-F的中性糖含量分别为89.35%、88.47%和87.26%，蛋白含量分别为1.59%、1.76%和1.65%，中性糖和蛋白含量差异不明显。APPs-H的糖醛酸含量低于APPs-V和APPs-F，差异显著（p< 0.05），这可能是由于APPs-H在干燥过程中氧气及高温对糖醛酸的破坏[17]。

2.2 APPs单糖组成

不同干燥方法得到的APPs的单糖组成见表2。

表2 不同干燥方法的APPs单糖组成Table 2 Monosaccharide composition of APPs dried by different methods %

从表2可以看出，3种APPs主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖4种单糖组成，APPs-H、APPs-V和APPs-F单糖质量分数比分别为：（2.43∶9.38∶1∶10.72）、（2.34∶9.67∶1∶11.06）和（2.46∶11.06∶1∶16.53）。其中APPs-H和APPs-V单糖组成差异不明显，APPs-F单糖组成与APPs-H和APPs-V差异明显（p<0.05），说明不同干燥方法不会影响多糖的单糖种类，但单糖的构成比例将会发生改变，这可能与干燥过程中单糖构象的改变有关[18]。

2.3 干燥方法对APPs抗氧化活性的影响

2.3.1 不同干燥方法对APPs清除DPPH自由基的影响

不同干燥方法对APPs清除DPPH自由基的影响结果见图1。

图1 不同干燥方法对APPs清除DPPH自由基的影响Fig.1 Scavenging effect of APPs dried by different methods on the DPPH radical

由图1可知，在0.5 mg/mL～3.0 mg/mL质量浓度范围内，APPs对DPPH自由基的清除率随APPs-H、APPs-V和APPs-F质量浓度的增加而提高，与APPs质量浓度呈正相关。在浓度为3.0 mg/mL时，APPs-H、APPs-V和APPs-F对DPPH自由基的清除率分别为44.37%、51.78%和58.35%，在相同质量浓度条件下，APPs-F对DPPH自由基能力最强，APPs-V次之，APPs-H最弱。

2.3.2 不同干燥方法对APPs清除羟基自由基的影响

不同干燥方法对APPs清除羟基自由基的影响结果见图2。

由图2可知，在0.5 mg/mL～3.0 mg/mL质量浓度范围内，APPs对·OH的清除率随APPs-H、APPs-V和APPs-F质量浓度的增加而提高，与APPs质量浓度呈正相关。在浓度为3.0 mg/mL时，APPs-H、APPs-V和APPs-F对·OH的清除率分别为65.73%、69.68%和75.28%，在相同质量浓度条件下，APPs-F对·OH清除作用最强，其次是APPs-V和APPs-H，但都弱于VC。

图2 不同干燥方法对APPs清除羟基自由基的影响Fig.2 Scavenging effect of APPs dried by different methods on hydroxyl free radical

2.3.3 不同干燥方法对APPs清除超氧阴离子自由基的影响

不同干燥方法对APPs清除超氧阴离子自由基的影响结果见图3。

图3 不同干燥方法对APPs清除超氧阴离子自由基的影响Fig.3 Scavenging effect of APPs dried by different methods on superoxid free radical

从图3中可以看出，APPs-H、APPs-V和APPs-F对超氧阴离子自由基清除率随APPs质量浓度的增加而提高，与APPs质量浓度呈正相关。在浓度为3.0 mg/mL时，APPs-H、APPs-V和APPs-F清除率依次为55.27%、57.64%、59.59%，在相同质量浓度条件下APPs清除超氧阴离子自由基能力为：VC>APPs-F>APPs-V> APPs-H。

2.3.4 不同干燥方法对APPs清除亚硝基自由基的影响

不同干燥方法对APPs清除亚硝基自由基的影响结果见图4。

从图4中可知，APPs-H、APPs-V和APPs-F对亚硝基自由基的清除率随APPs质量浓度的增加而提高，与APPs质量浓度呈正相关。在浓度为3.0 mg/mL时，APPs-H、APPs-V和APPs-F对亚硝基自由基的清除率依次为58.45%、60.43%和62.37%，在相同质量浓度条件下，APPs清除超氧阴离子自由基能力为：VC＞APPs-F＞APPs-V＞APPs-H，但是APPs-H、APPs-V和APPs-F对亚硝基自由基的清除率差异不明显。

图4 不同干燥方法对APPs清除亚硝基自由基的影响Fig.4 Scavenging effect of APPs dried by different methods on Nitroso free radical

2.3.5 不同干燥方法对APPs还原力的影响

不同干燥方法对APPs还原力的影响结果见图5。

图5 不同干燥方法对APPs还原力的影响Fig.5 Effect of APPs dried by different methods on reducing power scavenging

由图5可知，在0.5 mg/mL～3.0 mg/mL质量浓度范围内，还原力随APPs-H、APPs-V和APPs-F质量浓度的增加而增加，与APPs质量浓度呈线性关系。在浓度为3.0 mg/mL时，APPs-E、APPs-V和APPs-F还原力分别为0.303、0.322和0.544，APPs-F还原力最强，其次是APPs-V和APPs-H，但都弱于VC。

3 结论

本试验利用传统水提法提取白背毛木耳多糖，分别对传统热风干燥、真空干燥和冷冻干燥3种不同干燥方法对白背毛木耳多糖的化学组成和抗氧化活性进行研究，结果表明，白背毛木耳多糖为含有少量的蛋白质的酸性多糖，不同干燥方法将会影响其单糖组成和糖醛酸含量，抗氧化活性研究表明3种干燥方法得到的多糖APPs-H，APPs-V和APPs-F具有较强的清除DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和亚硝基自由基的能力和还原力，在一定浓度范围内多糖与抗氧化活性及还原能力之间呈正相关关系，不同干燥方法将会对白背毛木耳多糖抗氧化活性造成不同影响，其中APPs-F抗氧化活性最强，其次是APPs-V和APPs-H，因此冷冻干燥方法是制备APPs适宜的干燥方法。

[1]王波,鲜灵.黄背木耳白背木耳栽培新技术[M].上海：上海科学技术文献出版社,2005：12-14

[2]张丹凤,郑丽珠,陈国平,等.白背毛木耳43-28胞外多糖的提取与纯化[J].安徽农业科学,2010,38(31)：17461-17462

[3]张丹凤,郑仕栋,陈国平,等.白背毛木耳胞内多糖的提取与纯化[J].食用菌学报,2010,17(3)：51-54

[4]吴春敏,陈琼华.毛木耳多糖的抗凝血和降血脂作用[J].中国药科大学学报,1991,22(3)：164-166

[5]徐洲,刘静,冯士令,等.不同干燥方法对淫羊藿多糖化学性质和抗氧化活性的影响[J].食品工业科技,2015,36(19)：116-119,123

[6]程知庆,沈和定,姚理想,等.干燥方法对瘤背石磺多糖抗氧化性和还原力的影响[J].食品与机械,2015,31(6)：169-172

[7]吴振,李红,罗杨,等.不同干燥方式对银耳多糖理化特性及抗氧化活性的影响[J].食品科学,2014,35(13)：93-97

[8]Fan Liuping,Li Jinwei,Deng Kequan,et al.Effects of drying methods on the antioxidant activities of polysaccharides extracted from Ganoderma lucidum[J].Carbohydrate Polymers,2012,87(2)：1849-1854

[9]张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社,2003：46-48

[10]Lowry OH,Rosebrough N J,Farr AL,et al.Protein measurement with the folin phenol reagent[J].Journal of Biological Chemistry,1951, 193：265-275

[11]N Blumenkrantz,Gasboe Hansen.New method for quantitative determination of uronic acid[J].Aanalytical Biochemistry,1973,54：484-489

[12]Liu Lixiang,SunYi,Laura T,et al.Determination of polyphenolic content and antioxidant activity of kudingcha made from Ilex kudingcha C J Tseng[J].Food Chemistry,2009,112(1)：35-41

[13]Wang Hongyuan,Jiang Xiaolu,Mu Haijian,et al.Structure and protective effect of exopolysaccharide from P.Agglomerans strain KFS-9 against UV radiation[J].Microbiological Research,2007,162(2)：124-129

[14]Jiang Bo,Zhang Hongyan,Liu Changjian,et al.Extraction of watersoluble polysaccharide and the antioxidant activity from Ginkgo biloba leaves[J].Medicinal Chemistry Research,2010,19(3)：262-270

[15]徐怀德,秦盛华.超声波辅助提取光皮木瓜多糖及其体外抗氧化性研究[J].食品科学,2010,31(10)：106-111

[16]Wu Huichun,Chen Huaming,Shiau C Y.Free amino acids and pep-tides as related to antioxidant properties in protein ydrolysates of mackerel(Scomber austriasicus)[J].Food Research International, 2003,36(9/10)：949-957

[17]Ma L,Chen H,Zhu W,et al.Effect of different drying methods on physicochemical properties and antioxidant activities of polysaccharides extracted from mushroom Inonotus obliquus[J].Food Research International,2013,50(2)：633-640

[18]Wang Y,Liu Y,Huo J,et al.Effect of different drying methods on chemical composition and bioactivity of tea polysaccharides[J].International Journal of Biological Macromolecules,2013,62：714-719

Effect of Drying Methods on Antioxidant Activities of Polysaccharides from Auricularia polytricha

QIU Meng-ge，HUA Li-jun，TANG Yi，YIN Jie，LI Jia-qi，CHEN Yi-yong*
（School of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Auricularia polytricha was used as raw materials.Polysaccharides from Auricularia polytricha（APPs）were extracted using conventional water extraction.APPs-H，APPs-V and APPs-F were obtained with traditional hot-air drying，vacuum drying and freeze drying，respectively.Chemical composition and antioxidant activities of APPs-H，APPs-V and APPs-F were investigated.The results showed that APPs were acidic polysaccharides containing a small amount of protein.Different drying methods could affect the monosaccharide composition and uronic acid content.APPs-H，APPs-V and APPs-F had a stronger scavenging ability of DPPH radical，hydroxyl radical，superoxide anion free radical and nitroso free radical and reducing power.In a certain concentration range，APPs were positively correlated with the antioxidant activity and reducing capacity.Drying methods had different effects on the antioxidant activity of APPs.APPs-F had highest antioxidant activities，followed by APPs-V and APPs-H.Freeze drying was the best drying method for preparation of APPs.

drying methods；polysaccharidesfrom Auricularia polytricha；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.006

2016-05-30

常熟理工学院2015届本科毕业设计(论文)重点资助团队课题

邱梦鸽（1989—），女（汉），本科，研究方向：食品科学。

*通信作者：陈义勇（1974—），男（汉），副教授，博士，研究方向：食品科学与天然活性成分。