HPLC测定黑果枸杞中花青素的成分及含量

赵子丹，葛谦，牛艳，王晓菁，张艳

（宁夏农产品质量标准与检测技术研究所，宁夏银川750002）

HPLC测定黑果枸杞中花青素的成分及含量

赵子丹，葛谦，牛艳，王晓菁*，张艳

（宁夏农产品质量标准与检测技术研究所，宁夏银川750002）

建立黑果枸杞中花青素的高效液相色谱检测方法。采用酸化乙醇溶液超声提取黑果枸杞中的花青素，置于沸水浴中将花青素水解为常见的花色素。选用高效液相色谱-紫外检测器、Agilent-ZORBAX SB-C18色谱柱，以乙腈/ 0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，在525 nm波长处对6种常见花色素（矢车菊色素、天竺葵色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素）进行定量检测。结果表明，6种花色素在浓度为0.2 mg/L～100 mg/L范围内，与响应值呈线性关系，分别获得标准曲线方程及相关系数，r＞0.999；矢车菊色素、天竺葵色素、飞燕草色素、芍药色素、锦葵色素的仪器检出限均为0.02 mg/L，牵牛花色素的仪器检出限为0.05 mg/L；6种花色素的平均回收率在84%～106%，RSD值在0.5%～7.9%。

黑果枸杞；花青素；水解；高效液相色谱

花青素（anthocyanidin）是一类水溶性植物色素，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶中，是植物的主要呈色物质，使它们呈现红、蓝、紫等不同的颜色。花青素在自然条件下很少以游离状态存在，常与各种单糖以糖苷键的形式结合形成花色苷。黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科枸杞属多年生灌木，是我国西北地区特有的野生植物品种，其果实富含花青素，是典型的天然花色苷类植物色素资源[1]。近年研究表明，黑果枸杞花青素具有多种生理功能，包括抗氧化[2-4]、抗辐射[5]、抗衰老[6]以及调节血脂功能[7]，能有效防治动脉粥样硬化等慢性疾病[8]。同时，黑果枸杞花青素还具有安全、无毒、药食兼用的特性，作为一种天然色素在食品行业中的应用前景非常广阔[9-10]。

目前，对黑果枸杞花青素含量的测定方法有紫外-可见分光光度法[11-13]、高效液相色谱法[14-16]和高效液相色谱-串联质谱法[17-18]等。紫外-可见分光光度法操作相对简便，但无法测定出花青素的种类和准确含量；高效液相色谱-串联质谱法适合测定花青素含量较低的植物性样品，同时可用于鉴定一些未知结构的花色苷，然而含量较高的样品容易超出其线性范围；高效液相色谱法是目前检测花青素报道最多的方法，但是现有相关研究均只选择一种或两种花色素标准品进行检测，测定结果有失偏颇。自然存在的花青素种类繁杂、品种众多，利用高效液相色谱法直接分析需要购置多种标准品，成本较高，难以用于实际检测中。自然界中存在6种常见的花色素，分别是矢车菊色素（cyanidin）、天竺葵色素（pelargonidin）、飞燕草色素（delphinidin）、芍药色素（peonidin）、牵牛花色素（petunidin）和锦葵色素（malvidin）。通过强酸水解可将花青素转化成6种常见花色素中的一种或几种，因此，通过分析花色素来确定花青素的成分就成为一种简便有效的分析方法。本试验对黑果枸杞中花青素的提取试剂、提取条件、色谱条件等进行了较为细致的研究，以期建立黑果枸杞中花青素成分及含量测定的高效液相色谱法，为黑果枸杞中花青素的研究提供技术支撑，也为完善黑果枸杞的质量标准检测体系提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、甲醇、乙醇（色谱纯）：美国Fisher公司；盐酸、磷酸（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；超纯水（过0.22 μm滤膜）。

飞燕草色素标准物质（纯度≥97%）、矢车菊色素标准物质（纯度≥96%）、天竺葵色素标准物质（纯度≥97%）、芍药色素标准物质（纯度≥97%）、锦葵色素标准物质（纯度≥97%）：法国Extras Synthese公司；牵牛花色素标准物质（纯度≥99%）：日本Tokiwa公司。

1.2 仪器与设备

Waters 2695液相色谱仪（配2487紫外检测器）：美国Waters公司；XS205 DualRange电子天平（精度0.000 1 g）：瑞士Mettler Toledo公司；T25 digital型高速匀浆机：德国IKA公司；MS3 basic涡旋混匀器：德国IKA公司；DS-2510DTH型超声波清洗器：上海生析超声仪器有限公司；水浴锅：上海科恒实业发展有限公司；TDL-40离心机：上海安亭仪器有限公司；纯水机：美国Millipore公司；DHG-9240A型电热鼓风干燥箱：上海一恒仪器有限公司；精密移液枪：法国Gilson公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的制备

分别精密称取飞燕草色素、矢车菊色素、牵牛花色素、天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素6种标准物质各5.0 mg，分别用5%HCl甲醇溶解并定容至10 mL，充分摇匀，配制成500 mg/L的标准储备液，-20℃冷冻保存。

1.3.2 样品前处理

将黑果枸杞干果用高速万能粉碎机粉碎，准确称取1.000 0 g，置于250 mL磨口锥形瓶中，加入50 mL酸化乙醇提取溶剂。超声提取30 min后，置于沸水浴中冷凝回流1 h，取出后迅速冷却。当达到室温时，立即将样品过0.22 μm水相滤膜到2 mL的棕色小瓶中，待检测。

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent-ZORBAXSB-C18（4.6mm×250mm，5 μm），流动相为乙腈/0.1%磷酸溶液，流速0.8 mL/min，柱温为40℃，检测波长525 nm，进样体积10 μL。梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件Table 1 Mobile phase composition for gradient elution

2 结果与分析

2.1 色谱柱及流动相的选择

分别选择 Waters-XbridgeTM HILIC色谱柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），Waters-XbridgeTM C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent-ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以不同的流动相体系及不同的体积配比对6种花色素标准品的液相色谱检测条件进行优化。结果表明，Agilent-ZORBAX SB-C18色谱柱，以乙腈与0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，既与干扰组分达到有效分离，且同时保持6种花色素的基线分离度。6种花色素的相对保留时间分别为：12.1、15.8、16.9、19.4、20.8、21.5 min，重现性好。最终确定的梯度洗脱条件见表1，色谱图见图1。

图1 6种花色素色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of the six kind of anthocyanidins

2.2 黑果枸杞花青素提取方法的建立

2.2.1 黑果枸杞花青素提取试剂的选择

通常游离状态的花青素不稳定，在中性和碱性条件下极易分解，但在强酸条件下能稳定存在。目前，文献中记载关于花青素的提取方法主要有酸化水溶液提取法[19]、酸化乙醇提取法[20-21]、酸化有机溶剂提取法（包括甲醇、乙腈、丙酮）[22-24]等。因2.1中确定的流动相为乙腈与磷酸溶液，同时考虑乙醇提取的无毒性，因此分别选择酸化乙腈与酸化乙醇作为提取试剂，并针对两种提取试剂设计相应的提取优化试验，具体见表2。

表2 不同提取试剂条件下6种花色素的提取率Table 2 Extraction rates of the six kind of anthocyanidins with different reagents

结果表明，乙醇∶50%盐酸溶液（体积比50/50）相较于其它组合，提取率最高，因此选择该比例的酸化乙醇溶液作为提取试剂。

2.2.2 黑果枸杞花青素提取条件的选择

针对2.2.1确定的提取试剂，对黑果枸杞花青素的提取条件，即对酸解的温度及时间进行相应的优化，具体见表3。

结果表明，冷凝回流沸水浴加热的效果比烘箱加热的效果好，且冷凝回流沸水浴加热60 min时的提取率最高，因此，选择该条件为最佳提取条件。

表3 不同提取条件下6种花色素的提取率Table 3 Extraction rates of the six kind of anthocyanidins with different conditions

续表3 不同提取条件下6种花色素的提取率Continue table 3 Extraction rates of the six kind of anthocyanidins with different conditions

通过试验，确定样品经乙醇：50%盐酸溶液（体积比50/50）超声提取，再经过冷凝回流沸水浴水解60 min，即得黑果枸杞花青素提取液。待样品冷却后，过0.22 μm水相滤膜，上机检测。

2.3 标准曲线与检出限

分别配制0、0.2、1.0、5.0、10、50、100 mg/L 6种花色素的标准溶液系列，按照1.4的条件进行测定，测定结果采用外标峰面积定量，以标准溶液质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，分别获得标准曲线方程及R2值，结果表明6种花色素标准溶液的质量浓度与相应的色谱峰面积呈良好的线性关系，具体见表4。根据称样量为1 g，定容体积为50 mL，以3倍信噪比计算仪器检出限。

2.4 稳定性试验

取同一黑果枸杞样品提取液，按1.4色谱条件，将样品分别放置0、2、4、6、8、12、24 h后，通过高效液相色谱仪进行分析，记录保留时间及峰面积，计算样品中花色素保留时间及峰面积的RSD，结果其RSD值分别在0.13%～0.42%与0.22%～1.2%之间，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 回收率和精密度

分别向黑果枸杞空白试样中添加6种花色素的标准溶液，每种花色素的添加质量浓度各不相同，分别设计3个浓度水平，每个水平设计5个重复，静置30 min后与空白试样一同进行测定。结果表明，6种花色素的平均回收率为84%～106%，相对标准偏差为0.5%～7.9%，回收率、精密度均能满足检测要求，具体见表5，图2、图3。

表5 6种花色素的添加回收率和精密度结果（n=5）Table 5 Fortified recovery and precision of the six kind of anthocyanidins（n=5）

2.6 黑果枸杞样品的测定

在市场上购买不同产地的黑果枸杞样品，应用本研究建立的方法对样品进行检测分析，具体见表6。

结果表明，被检样品中均含有至少4种花色素，分别为飞燕草色素、牵牛花色素、芍药色素和锦葵色素，且主要为牵牛花色素。所检测的黑果枸杞样品中花青素的含量最高可达11.0 mg/g。

图2 黑果枸杞样品空白色谱图Fig.2 Chromatogram of blank sample of Lycium ruthenicum

3 讨论与结论

研究表明，花青素在光照条件下易降解，因此在样品制备和检测过程中，应尽量避光，以保证样品的稳定性。本研究仅对黑果枸杞中花青素经强酸水解成的常见花色素进行了分析研究。通过对购自不同产地的黑果枸杞进行测定，发现所含花青素的成分基本一致，仅在含量上有所差别，青海产地的黑果枸杞花青素含量总体高于其他产地，分析可能与产地环境有关。且黑果枸杞中所含色素主要为牵牛花色素，这与蓝莓所含色素主要为锦葵色素可做一区分。

图3 黑果枸杞样品添加标准品色谱图Fig.3 Chromatogram of Lycium ruthenicum added with standards

表6 试验样品中花青素的检测结果Table 6 Contents of Anthocyanins in different samples

本研究建立了高效液相色谱检测黑果枸杞中花青素成分及含量的方法。方法采用酸化乙醇溶液经沸水浴水解提取花青素，操作简便；提取样品无需再净化，直接过滤膜就可上机检测；应用高效液相色谱仪，采用Agilent-ZORBAX SB-C18色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，花青素与样品中的干扰物有效分离，从而达到准确定量。通过添加不同水平的6种花色素标准溶液，证明本方法精密度好、准确度高，是一种高效、准确、实用的方法。该方法的建立为黑果枸杞的产业发展奠定理论与实践基础，为黑果枸杞的开发和利用提供数据支撑。

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Determination of Anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.by HPLC

ZHAO Zi-dan，GE Qian，NIU Yan，WANG Xiao-jing*，ZHANG Yan
（Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products of Ningxia，Yinchuan 750002，Ningxia，China）

A high performance liquid chromatographic（HPLC）method was estabolished for the determination of anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr..The anthocyanidins in Lycium ruthenicum Murr.were extracted ultrasound with acidified ethanol，and then hydrolyzed into major anthocyanins in boiling water bath.A mixture of acetonitrile and 0.1%phosphoric acid was used as the mobile phase gradient elution for the chromatographic separation on Agilent-ZORBAX SB-C18 column by HPLC-UV detector.The six kinds of anthocyanidins including cyanidin，pelargonidin，delphinidin，peonidin，petunidin and malvidin were detected at 525 nm wavelength.Results showed that the linearity of the method（r>0.999）was good over the concentration range from 0.2 mg/L to 100 mg/L for six anthocyanidins.The limits of detection（LODs）of cyanidin，pelargonidinm，delphinidin，peonidin and malvidin were 0.02 mg/L，and the LOD of petunidin was 0.05 mg/L.The ranges of spiked average recoveries at different levels were 84%-106%with the relative standard deviations（RSDs）of 0.5%-7.9%in a real sample.

Lycium ruthenicum Murr.；anthocyanidin；hydrolysis；high-performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.027

2016-09-22

宁夏农林科学院院科技先导资金项目(NKYQ-14-06)；农业部农产品质量安全监管局特质性食用农产品营养组分识别与验证评估项目（GJFP201601501）

赵子丹（1985—），女（汉），助理研究员，硕士，研究方向：农产品质量标准与检测技术研究。

*通信作者：王晓菁（1972—），女（汉），研究员，硕士，研究方向：农产品营养与安全检测研究。