高效液相色谱测定雪糕中6种合成色素

尤妍

（玉环县食品药品检验检测中心，浙江台州317608）

高效液相色谱测定雪糕中6种合成色素

尤妍

（玉环县食品药品检验检测中心，浙江台州317608）

建立一种简便、重复性好的高效液相色谱可见光测定雪糕中的柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝6种合成着色剂。以无水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，体积比）为溶剂提取，HLB固相萃取柱净化，ZORBAXSB-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流动相以甲醇和20 mmol/L乙酸铵进行梯度洗脱。流速1.0 mL/min，柱温25℃，多波长同时测定6种的合成色素，检测波长分别为428、521、509、483、507、625 nm。结果表明：6种合成色素均达到基线分离，在0.1 μg/mL～10 μg/mL范围内，具有良好的线性关系（R2均大于0．999 9）；样品的样品加标回收率85%～110%，精密度RSD均小于2.0%。该方法可用于检测雪糕中合成色素的含量。

合成色素；雪糕；高效液相色谱

合成着色剂是指用人工化学合成方法制得的有机色素，主要是以煤焦油中分离出来的苯胺染料为原料制成。合成着色剂在体内蓄积分解成致突变原前体芳香胺类化合物，有些可能会转化成致癌物质[1-3]，过量摄入合成着色剂危害人体健康。若儿童过量食用含合成色素的食品，会影响儿童智力发育。同时也会干扰儿童正常的代谢功能。

雪糕中添加合成色素可以促进人们的食欲，提高食品的商品价值，GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》对柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝这6种合成色素在雪糕中最大使用量作了明确规定[4]。

目前合成着色剂的测定方法有高效液相色谱法[5-11]、毛细管电泳法[12-13]、液质联用法[14]。一般采用GB/T 5009.35-2003《食品中合成着色剂的测定》和SN/ T 1743-2006《食品中的诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测》的高效液相色谱法测定食品中的合成着色剂[15-16]，但是该方法未提及雪糕中着色剂测定的前处理方法，而且雪糕中含有稳定剂，按照GB/T 5009.35-2003的方法进行前处理，极易堵塞砂芯漏斗。因此，建立检测雪糕中的合成色素的测定方法具有重要意义。本试验旨在发现一种简便、可行的检测方法，为雪糕中色素的检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

安捷伦1260高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器、四元泵、在线脱气机、柱温箱、自动进样器、Open LAB工作站）：安捷伦科技有限公司；梅特勒XS205DH电子天平（万分之一）：梅特勒；DV-S26电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；Neofuge 18R台式高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司。

甲醇、乙腈：HPLC级，经0.45 μm滤膜过滤，超声脱气；3%氨水溶液：取氨水3 mL，加水定容至100 mL；乙酸铵溶液（20 mmol/L）：取1.54 g乙酸铵，加水溶解至1 000 mL，经0.45 μm滤膜过滤，超声脱气；盐酸-乙醇溶液：取10 mL盐酸，90 mL乙醇，混匀；50%甲醇：取50 mL甲醇，50 mL水，混匀；柠檬黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝、日落黄（0.50 mg/mL）：中国计量科学研究院；诱惑红标准储备液：准确称取60.24 mg诱惑红（纯度83%，农业部环境保护科研监测所）用水定容至100mL，配制成0.50 mg/mL的标准储备液。

1.2 样品

雪糕：市售。

1.3 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇为A相，20 mmol/L乙酸铵为B相，按照梯度程序洗脱（见表1）。流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长分别为：428、521、509、483、507、625 nm；进样量：10 μL。

表1 最佳梯度洗脱程序Table 1 Optimal elution conditions of synthetic pigments by HPLC

1.4 标准曲线

分别取0.5 mg/mL的柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝各5.0 mL于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，即得50 μg/mL的混合标准溶液。

取该混合标准溶液，依次配制成浓度为0.1、0.2、0.4、1、3、5、10 μg/mL的混合标准溶液。这7个梯度标准溶液各自进样10 μL，按照色谱条件进行检测，根据保留时间、峰面积及对应的浓度分别作校准曲线。

1.5 样品处理

试样处理：取完整的雪糕样品，室温下化冻，均质机匀浆，作为供试样品。

称取2 g样品（精确至0.01 g）于离心管中，加入乙醇-氨水-水（7∶2∶1，体积比）溶液约15 mL，置超声波中超声5 min，6 000 r/min离心5 min，过滤。再用30 mL乙醇-氨水-水（7∶2∶1，体积比）溶液重复提取3次，取滤液，于80℃水浴蒸至5 mL左右，用氨水溶液调节pH为8，作为待净化液。

取HLB净化小柱，先用8 mL甲醇，8 mL水活化，取待净化液过小柱，用pH值为8的水和pH值为8的甲醇水溶液（甲醇∶水=1∶1，体积比）各5 mL淋洗小柱，盐酸-乙醇溶液10 mL洗脱，洗脱液用氨水调至中性，80℃水浴蒸至近干，用50%甲醇溶液溶解并定容至10 mL，作为样品供试溶液。

2 结果与讨论

2.1 波长选择

利用二极管阵列检测器（DAD）对柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝分别进行波长扫描见图1。

图1 6种合成着色剂标准品的紫外-可见光谱扫描图Fig．1 UV-Visible spectra of six kinds of synthetic pigments

由图1可知，6种合成色素在紫外波长（254 nm）附近都有较强吸收，但样品中的一些杂质在该波长下有吸收，影响目标色素的判断（图2）。因此，采用可见光吸收波长作为检测波长。确定了柠檬黄的测定波长为428 nm，苋菜红的测定波长为521 nm，胭脂红的测定波长为509 nm,日落黄的测定波长为483 nm，诱惑红的测定波长为507 nm，亮蓝的测定波长为625 nm。采用以上可见光检测，样品的基质干扰少，各组分能有效分离。

2.2 标准曲线线性范围及线性关系

选择混合标准溶液的浓度分别为0.1、0.2、0.4、1、3、5、10 μg/mL，进高效液相色谱仪分析后，以各个组分的峰面积和浓度绘制标准曲线，以3倍性噪比计算检出限。6种色素在其0.1 μg/mL～10 μg/mL浓度范围内线性良好（见表2）。取1 μg/mL色素混合标准溶液，分别采用可见光和紫外光检测，结果（如图3）：采用可见光检测后6种色素的响应值较按照GB/T 5009．35-2003《食品中合成着色剂的测定》紫外光检测高，亮蓝尤其明显。

图2 阳性样品色谱图Fig.2 Chromatogram of positive sample

表2 各组分标准曲线及检出限Table 2 The detection limit of components and standard curve

图3 1 μg/mL标准溶液的色谱图Fig.3 Chromatogram of 1 μg/mL standard solution

2.3 方法精密度和加标回收率

取10 μg/mL的混合标准溶液进行精密度测定，重复测定6次，计算各组分峰面积精密度见表3。以雪糕阳性样品为试样，分别加入一定量的混标，计算回收率见表4。结果表明：6种人工合成色素的精密度均< 2.0%，样品加标回收率85%～110%，该方法适用于雪糕样品的检测。

表3 精密度试验结果Table 3 The precision of the result of the experiments

表4 样品加标回收率Table 4 The recovery of the standard addition

2.4 前处理方法的选择

目前合成色素的提取方法一般采用 GB／T 5009.35-2003《食品中合成着色剂的测定》的聚酰胺吸附法。试验分析比较了不同颗粒度聚酰胺粉对空白样品加标的吸附效果见表5。结果表明聚酰胺粉颗粒度对合成色素的吸附效果影响较大，颗粒度越小，吸附效果越好，但是＞200目的聚酰胺粉的价格昂贵，是100目～200目聚酰胺粉价格的近10倍，考虑100目～200目颗粒度的聚酰胺粉回收率满足一般检测需求，所以一般采用该规格的聚酰胺粉进行试验。当用聚酰胺粉对雪糕阳性样品进行处理时，由于雪糕中含有糖、增稠剂（卡拉胶、槐豆胶、瓜尔胶、羧基纤维素钠、罗望子多糖胶）等物质，在用G3砂芯漏斗（滤片平均滤孔15 μm～40 μm）洗脱的过程中出现砂芯堵塞、洗脱困难的现象。为解决这一难题，特采用乙醇-氨水-水提取的方法，先将目标色素提取出来，再利用HLB净化小柱对提取液进行净化，排除干扰。

表5 不同颗粒度的提取效果Table 5 Extraction efficiencys of differents granularity

3 结论

试验表明，利用高效液相色谱可见光测定雪糕中6种合成色素，能更精确地测定目标物，避免了一些干扰，各组份分离效果较好，标准曲线线性较好。同时，改进了样品前处理方法，避免了样品洗脱困难的发生，且方法回收率较高。试验证明，该方法适合雪糕样品中合成色素的含量的检测。

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Determination of Six Synthetic Pigments in Ice Cream by High Performance Liquid Chromatography

YOU Yan
（The Inspection Testing Center of Food and Drug in YuHuan，Taizhou 317608，Zhejiang，China）

To develop a method for the determination of six synthetic pigments such as tartrazine，amaranth，carmine，sunset yellow，temptation red，brilliant blue，fancy red in ice cream.Using anhydrous ethanol-ammonia-water（7∶2∶1，V/V）as solvent extraction，the synthetic pigments were cleaned by HLB cartridge.After exreacetd，samples were separated in a ZORBAX SB-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）column with gradient program by using methanol and 20 mmol/L ammonium acetate as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min，with the column temperature 40℃and detection wave 428，521，509，483，507，625 nm.The six synthetic pigments were separated.The linear range of menthod was in the range of 0.1 μg/mL-10 μg/mL：（R2＞0.999 9）.The recoveries for samples ranged from 85%-110%，and RSD were all below 2%.This methods were suitable for determination of synthetic colout in ice cream.

synthetic colorants；ice cream；high performance liquidchromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.032

2016-09-23

尤妍（1986—），女（汉），硕士研究生，工程师，研究方向：食品检测。