β-氨基丁酸抑制鸭梨果实采后青霉病的机理研究

井一诺，王雷

（1.聊城一中，山东聊城252000；2.聊城大学农学院，山东聊城252000）

β-氨基丁酸抑制鸭梨果实采后青霉病的机理研究

井一诺1，王雷2，*

（1.聊城一中，山东聊城252000；2.聊城大学农学院，山东聊城252000）

以鸭梨果实为试验材料，研究了β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）对采后常温贮藏条件（20±1℃）下鸭梨果实青霉病的抑制效果及相关酶活性。鸭梨果实经过20 mmol/L的BABA处理后接种Penicillium expansum孢子，然后在（20±1）℃的条件下贮藏6d，结果发现BABA处理显著抑制了青霉病的发生和病斑直径的扩展，提高了鸭梨果实中几丁质酶（chitinase，CHI）和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase，GLU）的活性，诱导了鸭梨果实中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）等抗病相关酶活性的提高，降低了多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）和果胶甲酯酶（pectinmethylesterase，PME）的活性，减少了鸭梨果实中超氧阴离子和过氧化氢的含量。结果表明，BABA通过诱导提高抗病性、减少水果组织中的活性氧和延缓果实软化，减轻鸭梨果实采后青霉病的发生。

β-氨基丁酸；鸭梨；青霉病；诱导抗病性

鸭梨（Pyrus bretschneideri Rehd.）果实颜色金黄，皮薄汁多，石细胞少，营养价值丰富，深受国内外消费者欢迎[1]。果实在成熟期和贮藏过程中易发生由扩展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病，严重影响了鸭梨的长期贮藏和销售[2]，造成了巨大的经济损失。传统上抑制水果采后真菌病害的方法是使用人工合成的化学杀菌剂，但由于化学药剂的残留以及真菌病害的抗药性等问题，使化学杀菌剂的应用受到了限制，而通过激发子的处理提高水果自身抗病性已成为防治采后病害的研究热点[3]。

BABA是羧酸的衍生物，是一种非蛋白质氨基酸，可以诱导多种水果产生生理、生化防卫反应以抵抗病原菌在贮藏、运输过程中对果蔬的侵染[4-5]。研究发现，BABA能够诱导多种作物如马铃薯、黄瓜等产生对多种病害的抗性[6-7]。研究结果也表明，BABA处理能够分别提高香蕉、冬枣和葡萄果实对炭疽病[8]、黑斑病[9]和灰霉病[10]的抑菌效果。但关于BABA对鸭梨果实采后青霉病的抑制效果及相关机理尚未见报道。因此，本试验研究了BABA处理对鸭梨果实采后青霉病的抑制效果和抗病相关酶活性以及对果实软化的影响，探讨BABA诱导鸭梨果实抗病性的可能机理，为BABA在水果采后贮运中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

氮蓝四唑、β-巯基乙醇、磷酸钠、邻苯二酚、愈创木酚、丙酮、盐酸羟胺、考马斯亮蓝、牛血清白蛋白、β-巯基乙醇、半胱氨酸、柠檬酸、磷酸氢二钠：国药集团化学试剂有限公司；BABA、几丁质：美国Sigma公司。

SP-752型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；SPX-250B生化培养箱：上海博讯实业有限公司；GL-20G-H型冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；FA1104N电子天平：上海精密科学仪器有限公司。

1.2 试验处理

青霉（Penicillium expansum）分离于自然发病的鸭梨果实，经鉴定和回接试验后，重新从发病的鸭梨果实中再次分离纯化，挑取病原菌单孢子将其接种于PDA培养基上扩大培养7 d，用无菌生理盐水将青霉孢子的浓度调整为5×104个/mL（血球计数板计数），现用现配。

试验中所用鸭梨采摘自山东省聊城市冠县果园，挑选大小均匀、成熟度和果色一致，没有机械损伤和病虫害的果实备用。所选果实随机分成2组（对照组和处理组），为避免交叉感染，先用75%的酒精擦拭鸭梨果实表面需要接种的部位，用无菌打孔器在果实的赤道部位打孔（深4 mm，直径2 mm）。处理组用微量移液器定量注入25 μL浓度为20 mmol/L的BABA，对照组注入等量的无菌水，2 h后在打孔处注入15 μL的青霉菌孢子菌悬液。接种结束后，用0.01 mm厚的聚乙烯保鲜袋分装果实，将果实贮藏于（20±1）℃、相对湿度为90%的生化培养箱中6 d，每隔2天测量鸭梨果实的发病率和病斑直径，同时取果实病斑外围2 mm～10 mm的样品，测定其他生化指标，每个处理20个果实，重复3次。

1.3 方法

1.3.1 发病率和病斑直径的测定

鸭梨果实上青霉病的病斑直径大于2 mm时，认定为是发病，发病率/%=（发病果个数/果实总数）×100；病斑直径用游标卡尺进行测量。

1.3.2 CHI和GLU活性的测定

使用5 mL浓度为0.1 mol/L柠檬酸-0.2 mol/L磷酸氢二钠缓冲液（pH 5.0）冰浴条件下匀浆，离心（12 000 r/min，4℃）15 min后，上清液用于测定几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性。根据陈学红等[11]的方法，以每分钟增加0.001个光密度所需要的酶量为1个几丁质酶活力单位；以每小时生成1 mg葡萄糖为1个β-1，3-葡聚糖酶活力单位，结果表示为U/mg蛋白质。

1.3.3 SOD和CAT活性的测定

SOD的活性按照张倩等[12]的方法进行，以抑制NBT光还原50%为1个酶活力单位。CAT的活性按照Liu等[13]的方法进行测定，以反应液每分钟在240 nm处吸光值变化0.001为1个酶活力单位，结果表示为U/mg蛋白质。

1.3.4 PPO和POD活性的测定

PPO活性依据Tian等[14]所描述的方法测量，使用5 mL浓度为0.2 mol/L的磷酸钠缓冲液（pH 6.5）中匀浆1 g水果组织离心得到上清液，反应液中含有0.1 mL的上清液，0.2 mL的邻苯二酚，吸光度值在420 nm处每分钟增加0.01为一个酶活力单位。POD活性用愈创木酚法测定[15]，吸光度值在470 nm处的每分钟变化为0.01为一个酶活力单位，结果表示为U/mg蛋白质。

1.3.5 PG和PME活性的测定

使用5 mL含NaCl（100 mmol/L）、β-巯基乙醇（2%）、半胱氨酸（0.2%）和PVP（1%）的乙酸钠缓冲液（40 mmol/L，pH 5.5）4℃下匀浆1.0 g果肉组织，离心（4℃，12 000 r/min）20 min后，上清液用于测定酶活性。依据Zhou等[16]的方法，测定PG活性，以半乳糖醛酸作为标准，测定反应液276 nm下的吸光度，每小时水解释放1 μmol/L半乳糖醛酸定义为一个酶活力单位；参照Wang等[17]的方法，测定PME活性，表示为每小时鸭梨果胶脱甲基释放1 μmol/L氢离子为一个酶活力单位。

1.3.6 超氧阴离子和过氧化氢含量的测定

冰浴条件下1.0 g果肉组织用5 mL冷丙酮均匀研磨，研磨后的匀浆在10 000 g下离心20 min（4℃）。取上清液依据Patterson等[18]的方法测定412 nm下的吸光度值。H2O2的含量表示为μmol/g FW。

超氧阴离子（O2·-）生成量的测定依据Li[19]的方法，用5 mL浓度为50 mmol/L的冷丙酮磷酸缓冲液（pH 7.8）研磨1g果肉组织，匀浆在10 000 r/min下离心15 min（4℃）。反应的混合液中有2 mL盐酸羟胺（1 mmol/L）和1 mL提取液，随后添加α-萘胺和苯胺，在25℃水浴下恒温20 min，测定530 nm下的吸光度值，结果表示为nmol/g。

1.4 数据处理与分析

采用Origin 8.5对试验数据进行分析，用邓肯多重比较方法进行差异显著性分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 BABA对鸭梨果实青霉病的抑制效果研究

BABA对鸭梨果实青霉病的抑制效果研究见图1。

图1 BABA对鸭梨果实采后青霉病的抑制效果Fig.1 Inhibitory effects of BABA on blue mold decay in pear fruit after harvest

如图1所示，鸭梨果实采后在常温（20±1）℃贮藏过程中，刺伤接种病原菌后，果实的发病率和病斑直径呈上升趋势，用BABA处理能够显著（P<0.05）抑制青霉病的发展，BABA处理抑制了鸭梨发病率的升高和病斑直径的扩展。贮藏期结束后，BABA处理显著（P<0.05）抑制了青霉病的发病率，处理组果实的病斑直径仅为对照组果实的69.7%。

2.2 BABA对鸭梨果实CHI和GLU活性的影响

BABA对鸭梨果实CHI和GLU活性的影响见图2。

图2 BABA对鸭梨果实采后CHI（A）和GLU（B）活性的影响Fig.2 Effects of BABA on activities of CHI（A）and GLU（B）in pear fruit after harvest

如图2所示，与对照相比，处理组鸭梨果实的CHI活性，在整个贮藏过程中呈上升趋势，对照组CHI的活性在贮藏前4天逐渐上升，随后略有下降，整个贮藏过程中处理组都显著（P<0.05）高于对照组。BABA处理在贮藏过程中可加大鸭梨果实GLU活性的提高速率，贮藏结束时BABA处理组果实的CHI和GLU活性分别比对照组高21.9%和22.2%。

2.3 BABA对鸭梨果实SOD、CAT、POD和PPO活性的影响

BABA对鸭梨果实SOD、CAT、POD和PPO活性的影响见图3。

如图3所示，鸭梨果实的SOD活性在贮藏的前4天上升迅速，随后处理组果实略有上升而对照组的活性略有下降，鸭梨果实的CAT活性在整个贮藏期间逐渐上升，BABA处理显著（P＜0.05）提高了SOD和CAT的活性。POD的活性在贮藏过程中表现出下降的趋势，BABA处理显著（P＜0.05）抑制了鸭梨果实中POD活性的下降。处理组鸭梨果实的PPO活性在贮藏的前4天迅速上升达到最大值，随后略有下降，对照组的活性在贮藏期内BABA处理显著（P＜0.05）提高了PPO活性的上升。

图3 BABA对鸭梨果实采后SOD（A）、CAT（B）、POD（C）和PPO（D）活性的影响Fig.3 Effects of BABA on activities of SOD（A），CAT（B），POD（C）and PPO（D）in pear fruit after harvest

2.4 BABA对鸭梨果实超氧阴离子和过氧化氢含量的影响

BABA对鸭梨果实超氧阴离子和过氧化氢含量的影响见图4。

如图4所示，对照组和处理组鸭梨果实的超氧阴离子和过氧化氢含量在整个贮藏期间表现出不同的上升趋势。鸭梨果实在（20±1）℃贮藏期间，对照组超氧阴离子的生成速率要高于处理组，这说明BABA处理能够显著（P＜0.05）抑制果实中超氧阴离子的生成。鸭梨果实中过氧化氢的含量在贮藏前2天差别不大，随后迅速增加，BABA处理显著（P＜0.05）抑制了其含量的增加。

图4 BABA对鸭梨果实采后超氧阴离子（A）和过氧化氢（B）含量的影响Fig.4 Effects of BABAon content of superoxide radical（A）and H2O2（B）in pear fruit after harvest

2.5 BABA对鸭梨果实PG和PME活性的影响

BABA对鸭梨果实PG和PME活性的影响见图5。

如图5所示，随着贮藏时间的延长，鸭梨果实采后PG和PME的活性逐渐增大。PG活性在贮藏的前4天增长较缓慢，随后上升速率加快，BABA处理显著（P＜0.05）抑制了PG活性的升高。对照组和处理组PME的活性在贮藏的前2天差异不明显，随后的贮藏期内，BABA处理显著（P＜0.05）抑制了PME活性的升高。

3 讨论

图5 BABA对鸭梨果实采后PG（A）和PME（B）活性的影响Fig.5 Effects of BABA on activities of PG（A）and PME（B）in pear fruit after harvest

使用生物或者非生物激发子诱导水果产生抗病性被认为是控制水果采后病害的有效手段，近几年BABA作为抗性诱导子在植物-病菌互作过程中的作用已被广泛研究，认为BABA是植物调控抗病信号路径的重要因子[20]。研究表明，BABA处理可以诱导多种植物对病原菌产生抗性；此外，BABA还可以保护作物减少非生物胁迫所造成的伤害，如干旱或高温等[21]。本文的研究结果发现，使用BABA处理显著减轻了鸭梨采后青霉病的发展，这说明BABA处理提高了鸭梨果实的抗病能力。

水果受到病原真菌侵染时，自身会产生抗病相关酶以抵抗病原真菌的进一步扩散。CHI和GLU是两种重要的抗性酶，可以水解病原真菌的细胞壁，抑制其生长[22]。BABA处理在采后葡萄[10]、香蕉[8]、苹果[23]等水果上都诱导了CHI和GLU活性的增加，最终提高了果实的抗病性，抑制了采后病害的发生。水果采后的衰老与其体内的活性氧自由基逐渐累积密切相关，SOD和CAT是植物体内活性氧（ROS）清除系统的主要部分，SOD能够催化过氧化氢，再由CAT催化变为无毒的水和氧气[24]。POD作为植保素和酚类化合物合成过程中的关键酶，参与了木质素的合成[25]。植物细胞受到病原真菌侵染时，PPO可将植物组织中的酚类物质转变为醌类等抗菌物质以抵抗病原菌[26]。超氧阴离子和过氧化氢作为活性氧物质，在果蔬组织中的大量存在会对细胞产生伤害，导致果实衰老和抗病性的下降[27]。Jiang等[27]的研究结果表明，葡萄果实用茉莉酸甲酯处理后SOD、CAT、PPO和POD活性显著提高，提高了葡萄果实的抗病性。本研究中，BABA处理提高了果实SOD、CAT、PPO和POD的活性，减少了果实中超氧阴离子和过氧化氢的含量，提高了鸭梨果实的抗病性。

水果的软化是个不可逆的生化过程，尤其是在水果成熟之后，水果的软化会促进病原菌的侵染，增加果实采后腐烂[28]。软化的过程与细胞壁水解酶的作用相关。PG和PME是作用于细胞壁中果胶的主要酶[29]。Cantu等[30]的研究发现，抑制番茄果实的软化能够降低番茄果实对灰霉病的敏感性。Wang等[24]的研究发现热空气处理能够通过抑制甜樱桃果实的软化提高了其抗病性。本研究中，BABA处理降低了鸭梨果实的PG和PME的活性，提高了果实抵抗青霉病的抗性。

4 结论

试验结果说明，BABA处理后显著降低了接种青霉菌鸭梨果实在20℃贮藏6 d的发病率和病斑直径。BABA显著促进了CHI、GLU、SOD、CAT、PPO及POD等抗性相关酶活性的提高，抑制了PG及PME等与软化相关的酶活性的升高，减少了鸭梨果实中超氧阴离子和过氧化氢的含量，减轻了鸭梨果实采后青霉病的发生。

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Study on the Mechanisms of β-Aminobutyric Acid Inhibiting Blue Mold Decay in Postharvest Pear Fruit

JING Yi-nuo1，WANG Lei2，*
（1.Liaocheng NO.1 Senior High School，Liaocheng 252000，Shandong，China；2.College of Agriculture，Liaocheng University，Liaocheng 252000，Shandong，China）

The effects of β-aminobutyric acid（BABA）on blue mold decay caused by Penicillium expansum in harvested pear fruit stored at（20±1）℃and the possible mechanisms were investigated.The pear fruits were pretreated with 20 mmol/L BABA，followed by inoculating with the spores of Penicillium expansum，and then stored at（20±1）℃for 6 d，the results showed that fruit treated with BABA had significantly lower disease incidence and smaller lesion diameter than the control fruit did.BABA treatment significantly enhanced activities of chitinase（CHI），β-1，3-glucanase（GLU），superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），peroxidase（POD），and polyphenoloxidase（PPO）.BABA treatment significantly suppressed the activities of polygalacturonase（PG）and pectinmethylesterase（PME）.BABA treatment reduced the content of superoxide radical and H2O2.The experimental results suggested that BABA could effectively suppress blue mold decay in pear fruit may be related to the induced disease resistance in the fruit，decreased the content of reactive oxygen spices in pear fruit tissue and delayed fruit softening.

β-aminobutyric acid；pear；blue molddecay；induceddisease resistance

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.037

2017-02-14

国家自然科学基金青年科学基金（31601521）

井一诺（2000—），女（回），高中。

*通信作者：王雷（1981—），男（汉），讲师，博士，研究方向：主要从事水果采后病害防治研究。