脉冲强光对枯草芽孢杆菌的致死工艺优化

赵天惠,张佰清,谢 旭

(沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866)



脉冲强光对枯草芽孢杆菌的致死工艺优化

赵天惠,张佰清*,谢 旭

(沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866)

采用响应面法分析优化脉冲强光对枯草芽孢杆菌致死的工艺参数。在单因素实验基础上,选取脉冲电压、脉冲次数、照射距离为影响因素,致死率为指标,通过响应面法进行优化设计。结果表明:脉冲强光对枯草芽孢杆菌的致死效果极显著(p<0.01),根据最优条件并结合实际操作,优化工艺参数为脉冲电压2450 V、脉冲次数65次、照射距离5 cm时,致死率可达到99.95%,各因素对致死率影响大小顺序为A(脉冲电压)>C(照射距离)>B(脉冲次数),为日后食品保藏和加工中枯草芽孢杆菌的灭活提供依据。

脉冲强光,枯草芽孢杆菌,致死率,响应面

微生物的生长繁殖引起食品腐败变质的现象十分普遍,由此造成的食品原料损失数量巨大。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是革兰氏阳性产芽孢菌,作为食品中常见的一种污染菌[1],对食品保藏造成巨大危害,特别是富含淀粉质食品,枯草芽孢杆菌是造成其腐败的主要菌种[2]。目前,食品中抑制枯草芽孢杆菌的主要方法是添加防腐剂,不仅存在一定的安全性隐患,还可能会造成食品感官品质的下降,如生牛肉表面发黏、腌制的金枪鱼肉质糜烂[3]。因此,新型非热杀菌技术受到日益重视并迅速发展,脉冲强光杀菌技术就是其中之一。

脉冲强光杀菌技术是一种具有广阔发展前景的冷杀菌技术,利用与太阳光谱相近、但强度更高的脉冲光能量而瞬时杀灭微生物[4-6]。由于其显著优点,该技术被广泛应用于食品微生物灭活和酶钝化[7]。江天宝[8]和张佰清等[9-10]利用脉冲强光杀菌技术对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行杀菌实验,致死率分别为99.9%和99%。Caroline[11]研究发现,脉冲强光对喷洒在不同材质表面上的黑曲霉孢子的致死效果不同,在聚苯乙烯表面上的黑曲霉孢子的致死效果稍高于玻璃表面。Takeshita[12]研究了脉冲强光对食源性病原菌的杀灭效果,结果发现如果脉冲光波长在300 nm以下的光被滤去,杀菌效果降低,杀菌时间随之延长。Marquenie[13]研究表明,脉冲强光照射40 s和41 ℃热处理15 min结合,可使草莓灰霉菌孢子完全失活。

目前,江天宝[14]研究了脉冲强光的闪照时间对不同微生物的杀灭效果,结果发现全部杀灭大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉的闪照时间分别为12、14、16 s,表明不同微生物对脉冲强光处理耐受性由强到弱依次顺序为黑曲霉、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。Levy等[15]研究发现,枯草芽孢杆菌的芽孢比菌体细胞对脉冲强光的处理更具有抵抗性。Nicorescu等[16]利用脉冲强光分别处理枯草芽孢杆菌菌悬液和接种于香料中的菌株,研究发现脉冲强光对液态菌株的处理不影响其形态,却严重破坏了固态菌株的细胞壁,改变其DNA结构,导致菌株死亡。本文在前期实验的基础上,采用脉冲强光杀菌技术对枯草芽孢杆菌进行致死效应研究。以脉冲电压、脉冲次数和照射距离为影响因素,致死率为指标,进行单因素实验研究。在此基础上,采用响应面法进行优化设计,得出最优致死条件,希望为日后食品保藏和加工中枯草芽孢杆菌的灭活提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis) 由沈阳农业大学土地与环境学院微生物实验室提供；牛肉膏蛋白胨培养基 参照郝林的方法配制[17]。

脉冲强光装置 脉冲宽度为20 μs,波长为200～1100 nm,输出最大电压为5000 V,输入最大能量为644 J，沈阳农业大学食品学院自行设计;HZQ-F160A恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司;PHS-3C型酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司;电热手提式高压蒸汽消毒锅 上海三申医疗器械有限公司;紫外可见分光光度计 上海尤尼科仪器有限公司;3K15型离心机 sigma公司;HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养液的制备 菌株活化24 h之后,接种到液体培养基中32 ℃摇床培养12 h,形成种子液,将种子液培养6 h后形成处于对数生长期的培养液,配成浓度为106个/mL,存于4 ℃冰箱备用。

1.2.2 脉冲强光处理与致死率的测定 在无菌环境中,将放置在培养皿中的培养液放入脉冲装置处理室,使培养皿与氙灯垂直,进行脉冲强光处理,利用平板菌落计数法测定菌落总数,以不同处理条件下的菌株致死率来评价菌株的致死效果。

致死率(%)=(未处理活菌数-处理后活菌数)/未处理活菌数×100

1.2.2.1 单因素实验 分别以脉冲电压、脉冲次数、照射距离为实验因素,固定两个因素,分别对另外一个影响因素进行实验,测定各因素对菌株致死效果的影响。以原始菌株作为对照。

当脉冲次数为60 次,照射距离为6 cm,分别研究脉冲电压为300、500、1000、1500、1800、2000、2500 V时对菌株致死率的影响。

当脉冲电压为2000 V,照射距离为6 cm,分别研究脉冲次数为8、21、34、47、60、73次时对菌株致死率的影响。

当脉冲电压为2000 V,脉冲次数为60 次,分别研究照射距离为4、6、8、10、12 cm时对菌株致死率的影响。

1.2.2.2 响应面实验设计 根据单因素实验结果,以菌株致死率为响应值,对脉冲电压、脉冲次数、照射距离进行3因素3水平实验设计[18]。利用Design Expert 8.0.6软件进行工艺参数的优化组合,采用Box-Behnken响应面分析[19]得到回归模型和优化的工艺参数。实验因素和水平如表1所示。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels in the response surface design

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 脉冲电压对菌株致死效果影响 由图1可知,枯草芽孢杆菌致死率随脉冲电压增大而增大,且不同脉冲电压对菌株致死率存在显著差异(p<0.05),这可能是因为脉冲电压增大时,脉冲强光的能量增强,高能辐射导致瞬间温度升高,造成菌体细胞内水分快速蒸发形成微小的蒸汽,从而导致细胞膜膨胀破裂,细胞质泄露,造成菌株致死率提高[20-21]。在脉冲电压0～1500 V范围内,致死率显著升高,当脉冲电压为2000 V时,菌株的致死率为97.91%;当脉冲电压大于2000 V时,随脉冲电压的增大,虽然致死率继续升高,但趋势变缓慢;当脉冲电压为2500 V时,致死率达到最大值为98.4%。综合考虑两评价指标的最适脉冲电压,选取1500、2000、2500 V继续对枯草芽孢杆菌的致死效果做响应面分析以确定最佳的脉冲电压。

图1 脉冲电压对菌株致死效果影响研究Fig.1 The study on lethal effects of the strains from pulse voltage

2.1.2 脉冲次数对菌株致死效果影响 由图2可知,枯草芽孢杆菌的致死率随脉冲次数增加而增大。这可能是由于菌株的致死率与光流量呈正相关,随脉冲次数的增加,每次释放的光流量逐渐积累,最终得到的光流量总量增大,菌株致死率提高[7]。在脉冲次数为0～60次的范围内,枯草芽孢杆菌的致死率显著提高;当脉冲次数达到60次时,致死率为97.09%;当脉冲次数大于60次时,随脉冲次数的增加,致死率上升幅度减小,趋于平缓。在脉冲次数为73次时,致死率最大值为98.11%。综合考虑两评价指标的最适脉冲次数,选取47、60、73 次继续对枯草芽孢杆菌的致死效果做响应面分析以确定最佳的脉冲次数。

图2 脉冲次数对菌株致死效果影响研究Fig.2 The study on lethal effects of the strains from pulsed light times

2.1.3 照射距离对菌株致死效果影响 由图3可知,枯草芽孢杆菌的致死率随照射距离的增加而减小,方差分析表明,不同照射距离对菌株致死率存在显著差异(p<0.05)。这可能是由于菌液距离灯越近,杀菌效果越显著,可能是距离的缩短增强脉冲强光的光化学和光热作用,而脉冲强光对微生物的杀灭是光热和光化学效应共同作用的结果[22]。照射距离在6 cm范围内,照射距离对枯草芽孢杆菌的致死效果影响不大,但照射距离大于6 cm时,致死效果明显降低。当照射距离为6 cm时,致死率为96.47%,与照射距离为4 cm时相比,致死率仅下降了2.42%;当距离为10 cm时,致死率为43.76%,比照射距离为6 cm时的致死率下降了54.64%。综合考虑两评价指标的最适照射距离,选取4、6、8 cm继续对枯草芽孢杆菌的致死效果做响应面分析以确定最佳的照射距离。

图3 照射距离对菌株致死效果影响研究Fig. 3 The study on lethal effects of the strains from irradiation distance

2.2 实验模型的建立及显著性检验

在单因素研究基础上,根据Design Expert 8.0.6软件进行实验设计,以脉冲电压、脉冲次数、照射距离为因素,以致死率为响应值(Y),进行响应面实验,实验设计及结果见表2、表3。

表2 响应面分析方案及实验结果Table 2 Program and experimental results of RSA

将实验数据进行回归拟合,得到以致死率(Y)为目标函数的二次回归方程模型为:

Y(%)=98.92+4.59A+0.90B-2.14C-3.20AB-3.18AC-1.30BC-6.15A2-2.83B2-6.50C2

该模型极显著(p<0.0001),失拟项不显著(p>0.05),模型的校正后系数R2adj为0.9973,表示该模型成立,方程与实际拟合较好。能有效反映出菌株的致死率与脉冲电压、脉冲次数和照射距离之间的关系,因此,该方程能预测响应值随各参数的变化规律。

模型一次项(A、C)、交互项(AB、AC)、二次项(A2、C2)极显著;二次项B2显著;一次项B、交互项BC不显著。由显著性大小可看出,各因素对致死率影响大小顺序为A(脉冲电压)>C(照射距离)>B(脉冲次数)。

2.3 响应面分析与优化

回归模型方程的响应面分别见图4～图6。对响应面及等高线图进行分析,可以直观地看出优化区域和不同因素之间相互作用的程度[23]。此外,椭圆形等高线图表示两两之间的交互作用比较显著。

图4 脉冲电压、脉冲次数的响应面Fig.4 Response surface curve for pulse voltage and pulse frequency

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

图5 脉冲电压、照射距离的响应面Fig.5 Response surface curve for pulse voltage and irradiation distance

图6 脉冲次数、照射距离的响应面Fig.6 Response surface curve for pulse frequency and irradiation distance

注:*差异显著(p<0. 05);**差异极显著(p<0. 01)。

由图4可知,将照射距离控制在0水平,随着脉冲电压和脉冲次数的增大,菌株致死率逐渐增强,且两者交互作用影响极显著。当脉冲次数为60次,脉冲电压为2000V以上时,菌株致死率均在95%以上。随着脉冲电压增大,脉冲电能增加,菌株死亡率越高。符合Oms等[24]认为脉冲强光的照射能量越强,对微生物的抑制作用越显著的观点。由图5可知,将脉冲次数控制在0水平,菌株致死率与脉冲电压成正比,与照射距离成反比。且两者交互作用影响极显著。由图6可知,将脉冲电压控制在0水平,随着脉冲次数增大,菌株致死率呈递增趋势;随着照射距离增大,菌株致死率呈递减趋势。且两者交互作用影响不显著。

分析回归模型并结合响应面图可确定脉冲强光对菌体致死的最优条件为:脉冲电压2446.18 V,脉冲次数64.55次,照射距离5.46 cm,此条件下预测的致死率为99.59%。结合实际操作,优化工艺参数,即脉冲电压2450 V,脉冲次数65次,照射距离5 cm,并对最佳条件做3次重复实验进行验证,结果得到菌株致死率为99.95%,实验值与预测值相差很小,所得参数较为可靠。表明该模型可以较好地反映出脉冲强光对枯草芽孢杆菌的致死效果,具有一定的实际指导意义。

3 结论

本研究表明,脉冲强光对枯草芽孢杆菌的致死效果明显,在单因素实验基础上,利用响应面法优化脉冲强光对枯草芽孢杆菌的致死工艺,建立了致死率与脉冲电压、脉冲次数和照射距离3个因素间的二次回归方程模型。最佳致死条件为:脉冲电压2450 V、脉冲次数65次、照射距离5 cm,该条件下致死率可达99.95%。各因素对致死率影响大小顺序为A(脉冲电压)>C(照射距离)>B(脉冲次数)。因此,脉冲强光可有效致死枯草芽孢杆菌,有助于避免微生物污染造成的食品腐败,并在一定程度上可发挥其在食品保藏中防腐剂的替代作用。

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Optimization of pulsed light parameters for lethal effect ofbacillussubtilis

ZHAO Tian-hui,ZHANG Bai-qing*,XIE Xu

(College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

Response surface methodology was adopted to optimize pulsed light parameters for lethal effect ofbacillussubtilis. On the basis of single factor experiments,through the response surface experiment design,pulse voltage,pulse frequency,irradiation distance were selected as the response factor,and the fatality rate was investigated. The results showed that the lethal effect of pulse light onbacillussubtiliswas extremely significant(p<0.01),according to the optimal conditions and combined with the actual operation,the optimized parameters were pulse voltage of 2450 V,pulse number of 65,distance of 5 cm,the fatality rate can reach 99.95%,and the order of the influencing factors was A(pulse voltage)>C(distance)>B(pulse number),and that can be the basis ofbacillussubtilisexisted in the preservation and the processing of food is inactivated in the future.

pulsed light;bacillussubtilis;fatality rate;response surface

2016-12-29

赵天惠(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：食品冷杀菌理论与技术,E-mail：1183412100@qq.com。

*通讯作者:张佰清(1966-)，男，博士，教授，研究方向:农产品加工技术,E-mail：sybaiqingxl@sina.com。

TS201.3

B

1002-0306(2017)11-0214-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.032