急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞检测及其对细胞凋亡的作用

吴琼，王小中

(南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006)

急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞检测及其对细胞凋亡的作用

吴琼，王小中

(南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006)

目的研究CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在急性白血病患者外周血中的检测，并探讨其对细胞凋亡的作用。方法将65例急性白血病患者(包括急性淋巴细胞性白血病33例和急性髓系白血病32例)分为未缓解组(28例)和缓解组(37例)，25例健康志愿者作为对照组。根据是否合并感染又分为合并感染组(39例)和未合并感染组(26例)。采用细胞内染色的流式细胞术及荧光定量PCR的方法，分别在蛋白质和mRNA水平检测Foxp3表达，并与正常对照组进行比较。同时，利用荧光定量PCR的方法的检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、P53的表达。结果与正常对照相比，急性白血病患者（未缓解组和缓解组）外周血中CD4+CD25+Foxp3+比例明显提高，且治疗缓解后CD4+CD25+Foxp3+表达下调（P＜0.05）。凋亡相关基因Bcl-2表达上调，Bax、P53表达下调。结论急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞明显升高，并且，影响凋亡相关基因Bcl-2、Bax、P53的表达，提示CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞可能通过细胞凋亡信号通路影响急性白血病的发展。

急性白血病；流式细胞术；CD4+CD25+Foxp3+；调节性T细胞；细胞凋亡

急性白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病，是常见的血液恶性肿瘤，多种免疫机制参与白血病的发生发展过程。在抗肿瘤免疫效应中，细胞免疫比体液免疫起着更为重要的作用[1]。CD4+CD25+调节性T细胞是（T regulatory cells， Treg)具有抑制自身免疫反应、阻止损伤性免疫病理发生和维持机体免疫平衡作用的T细胞亚群，具有抑制细胞免疫，并诱导肿瘤免疫逃逸作用[2]。转录因子FoxP3是Treg的特异表面标志，参与维持其发育和功能，其表达水平能更为精确地反映CD4+CD25+Treg的活性[3，4]，是Treg检测的关键标志之一[5]。本研究采用流式细胞术(flowcytometry，FCM)进行细胞内染色，检测细胞核内表达的Foxp3分子，并结合PCR反应的高度特异性和灵敏性进行共同检测，同时，对细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、P53的mRNA采用PCR方法进行检测，旨在研究急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达情况，为进一步研究CD4+CD25+Foxp3+促进急性白血病发生发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病例选择2014年2月-2015年12月间在江西省南昌大学第二附属医院院血液内科住院的65例急性白血病患者，其中男34例，女31例，年龄18～55岁(38.12±13.58岁)。25例在我院体检的健康志愿者(男15例，女10例，年龄30.21±13.31岁)作为对照组。所有病例均经临床、骨髓形态学、细胞化学染色及免疫分型确诊。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)33例，急性髓系白血病(AML)32例。按治疗效果分类，28例未达到完全缓解，纳入白血病未缓解组，37例通过规范化疗已经达到完全缓解，纳入白血病缓解组。在这65例患者中，取血时出现合并感染(包括消化道感染、肺部感染和口腔黏膜感染等)的有39例，无明显感染征象的26例。所有标本取血前均征得患者本人知情同意。

1.2 主要试剂荧光标记的抗体：PE标记的抗人CD4、PE-Cy5标记的抗人CD25及FITC标记的抗人Foxp3试剂盒(含配套的固定和透膜试剂)均购自EB ioscience公司；淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)；RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen)；逆转录及荧光定量PCR试剂盒(Takara)。

1.3 细胞表面及细胞内染色采集外周血2ml加入EDTA抗凝管，充分混匀；准备两根流式管，标明同型对照管和检测管，分别用1、2表示；取外周血100μl分别加入两管，1、2管都加入CD4-FITC/ CD25-APC各20μl，暗室室温避光孵育20min；避光孵育后加入稀释的溶血素和破膜剂，反应后以破膜缓冲液洗涤并重悬，1管加入IgG-PE 5μl，2管加入Foxp3-PE 20μl，暗室室温避光孵育20min；加入5ml PBS缓冲液洗涤，1200r/min离心5min去上清。加入400μl PBS缓冲液上机检测。

1.4 流式细胞仪检测用FSC/SSC参数先找到淋巴细胞群，找到CD4+CD25+双阳细胞群，IgG-PE为同型对照，使用对照管调整补偿和电压，使得阴性细胞群位于点图的左下角，收集至少10000个细胞，以CD4+CD25+双阳细胞射门，分析Foxp3的百分率，在计算机上用Cell Quest软件分析数据，减去阴性对照管的非特异性对照值。

Foxp3+在CD4+中的比例分析：步骤同上，1，2管破膜之前只要加入CD4-FITC 20μl，用FSC/SSC参数先找到淋巴细胞群，找到CD4+阳性细胞群，IgG-PE为同型对照，使用对照管调整补偿和电压，使得阴性细胞群位于点图的左下角，收集至少10000个细胞，以CD4+阳性细胞射门，分析Foxp3的百分率，在计算机上用Cell Quest软件分析数据，减去阴性对照管的非特异性对照值。

1.5 定量PCR的检测

1.5.1 总RNA抽提及逆转录反应采用Trizol试剂提取外周血单个核细胞总RNA，取总RNA 2μg进行逆转录反应合成cDNA。其中RNA的质量通过Nanodrop仪进行定性和定量检测。

1.5.2 荧光定量PCR检测Foxp3 mRNA表达取上述cDNA，采用Takara公司SYBR Green Taq试剂盒进行荧光定量PCR反应，总体积为10μl，按试剂说明书操作。Foxp3的表达水平以其与内参β-actin的比值表示。所用定量PCR仪型号为罗氏Lightcycler。引物由上海生工合成，引物序列见表1。PCR程序设定：预变性95°C 3min，变性95°C 30s，退火56°C 30s，延伸72°C 30s，35个循环，4°C保存。

1.6 统计处理采用SPSS软件进行统计学处理，多组及组间比较采用t检验，以P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 流式细胞术检测急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达应用流式细胞术双标记技术检测急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+的表达，结果发现，与正常对照相比，急性白血病患者（未缓解组和缓解组）外周血中CD4+CD25+Foxp3+比例明显提高，且治疗缓解后CD4+CD25+Foxp3+表达下调（P＜0.05）（见图1和表2）。进一步用荧光定量PCR方法检测Treg表面Foxp3基因的mRNA的表达情况，结果与流式细胞术检测结果一致，见图2。这一结果提示CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达与急性白血病有一定相关性，并且可能与急性白血病的治疗缓解相关。

图1 流式细胞术检测急性白血病患者外周血Foxp3的表达

图2 荧光定量PCR检测急性白血病患者外周血中Foxp3 mRNA表达

表2 流式细胞术检测急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例(%)

2.2 合并感染组和未合并感染组患者CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的的表达比例在上述基础之上，根据是否合并其它感染，将65例急性白血病样本分合并感染组和未合并感染组。流式细胞术双标记检测合并感染组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例为4.63±0.49%，未合并感染组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例为4.36±0.56%，两组之间的差异无统计学差异，见表3。

表3 合并感染组和未合并感染组患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例(%)

2.3 细胞凋亡相关基因Bcl2、Bax、P53 mRNA表达水平检测Treg在细胞凋亡中起着非常重要的作用[6]，为此，我们通过荧光定量PCR方法检测了凋亡通路中的重要基因Bcl2、Bax、P53的表达，结果显示，在急性白血病患者（缓解组及未缓解组）中Bcl2表达上调、Bax及P53表达下调（见图3）。

图3 荧光定量PCR检测急性白血病患者及健康对照组外周血中Bcl2、Bax、P53基因mRNA表达

3 讨论

急性白血病是造血干细胞异常分化的克隆性恶性疾病，严重威胁人类健康。Tregs是一种专职抑制细胞，具有独特免疫调节作用，人类主要由胸腺体天然产生Tregs，占人外周CD4+T细胞总数的5%～10%[7]，其表面表达有CD25、CTLA-4、GITR和Foxp3等分子。其主要功能是维持内环境稳定、抑制机体对同种异体移植物的排斥反应以及影响其他T细胞的功能等[8]。目前有关CD4+CD25+与肿瘤的关系有了大量研究，在胃癌、乳腺癌、肝癌等实体肿瘤患者的外周血和肿瘤局部，CD4+CD25+Treg的数量都比正常人明显增高，并且，其数量与病人肿瘤的进展程度以及预后呈负相关[9-11]。有关CD4+CD25+Treg的研究也存在一定的不一致性，这有可能与CD4+CD25+不能完全代表Treg细胞与肿瘤的相关性有关[12]。Foxp3属于foxhead家族分叉头/翼状螺旋转录调节因子，是细胞获得性的关键转录因子，目前认为Foxp3是Treg的特异性标志，其表达正常是CD4+CD25+Treg发挥作用的重要前提[13]。

为此，我们收集了江西地区的65例急性白血病患者和25例正常体检患者，采用双标记流式细胞术技术和荧光定量PCR技术，检测了CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的表达。结果提示，急性白血病患者（未缓解组和+缓解组）外周血中CD4+CD25+Foxp3+比例比正常对照组明显提高，且治疗缓解后CD4+CD25+Foxp3+表达下调（P＜0.05）。进一步设计采用荧光定量PCR方法检测Treg表面Foxp3+基因的mRNA的表达，结果与流式细胞术检测结果一致。本研究提示CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达与急性白血病有一定相关性，并且可能与急性白血病的治疗缓解相关。白血病患者由于骨髓造血系统异常，导致免疫力下降，易于发生各种并发感染，本研究将收集的65例急性白血病患者分为合并感染组和未合并感染组，比较两组患者中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的表达比例，由于可能本研究病例数尚少，未见差异具有统计学意义，有待进一步收集样本，在更大范围内检测CD4+CD25+Foxp3+Treg在急性白血病患者中的表达。

Treg细胞在调节细胞凋亡方面起着重要作用[6]，为了进一步研究CD4+CD25+Foxp3+Treg对急性白血病的调节机制，我们采用荧光定量PCR检测了细胞凋亡信号通路中的关键基因Bcl-2，Bax，P53的mRNA的表达，结果发现，Bcl-2在急性白血病中表达上调，而Bax及P53表达下调。Bcl-2是体内的重要抑制凋亡基因，能阻断凋亡信号传递的最后通路而抑制凋[14]，Bax及P53是细胞内促凋亡基因，这一研究结果提示CD4+CD25+Foxp3+Treg有可能通过抑制细胞凋亡促进急性白血病发生发展。Foxp3作为一种转录因子，定位于细胞内，绝大多数文献报道的检测手段是采用Western blot检测其蛋白质的表达水平[15]。本实验我们建立了流式细胞术合并荧光定量PCR共同检测Foxp3的方法，这两种方法均是可大范围的运用于临床的，该方法学的建立，可将为CD4+CD25+Foxp3+Treg外周血检测在临床推广应用。

本研究为进一步认识CD4+CD25+Foxp3+Treg在急性白血病中的作用提供了实验依据，为急性白血病患者的诊断和预后提供了可供选择的新思路，但急性白血病细胞对CD4+CD25+Foxp3+Treg进行精细调节以及哪些药物可以通过靶向CD4+CD25+Foxp3+Treg达到抑制或治疗急性白血病，这些问题均有待后续进一步深入研究。

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Peripheral Blood Cd4+Cd25+Foxp3+Regulatory T Cells Detection And Its Effect On Cell Apoptosis In Acute Leukemia

WU Qiong，WANG Xiaozhong.
Department of Clinical Laboratory，Second Affiliated Hospital，Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Objective To study the detection of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in cute leukemia patients’peripheral blood，and discuss its influence on cell apoptosis.Methods Sixty-five cases of patients with acute leukemia(including 33 cases of acute lymphocytic leukemia and 32 cases of acute myeloid leukemia)were divided into un-relieved group(28 cases)，completely relieved group(37 cases).And 25 healthy volunteers were selected as control group.According to whether accompanied with infection，65 cases of patients were also divided into leukemia accompanied with infection group(39 cases)and not accompanied with infection group(26 cases).Compared to normal control group，FoxP3 expression was detected in the protein and mRNA level using flow cytometry(FCM)and fluorescent quantitative PCR(qPCR)methods.At the same time，apoptosis related genes Bcl-2，Bax，P53 were detected by qPCR.Results Compared with normal controls，peripheral blood CD4+CD25+Foxp3+proportion increased significantly in the patients with acute leukemia(un-relieved group and completely relieved group).And CD4+CD25+Foxp3+expression reduced after therapy(P＜0.05).As cell apoptosis related genes，Bcl-2 was unregulated，while Bax and P53 were down regulated. Conclusion CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells are upregulated in acute leukemia patients’peripheral blood，and cell apoptosis related genes were influenced，indicating that CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells influence the development of acute leukemia through apoptosis signaling pathways.

∶Acute leukemia；Flow cytometry；CD4+CD25+Foxp3+；Regulatory T cells；Cell apoptosis

R733.7，R446.62

A

1674-1129(2017)03-0304-04

2016-11-24；

2017-05-17)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.004

江西省自然科学基金项目，编号：2014ZBAB205010

吴琼，女，1984年生，主管技师，流式细胞术。

王小中，男，1973年生，主任技师，教授，主要从事临床检验诊断学。