苦丁茶甲醇提取物对过氧化氢诱导巨噬细胞炎症的影响

钟 韬，柳贤德

（海南大学动物医学专业，海南海口570228）

苦丁茶甲醇提取物对过氧化氢诱导巨噬细胞炎症的影响

钟 韬，*柳贤德

（海南大学动物医学专业，海南海口570228）

通过苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对过氧化氢诱导巨噬细胞（RAW264.7）的处理，分析苦丁茶提取物和绿原酸对氧化应激模型一氧化氮（NO），IL-6及TNF-α的影响。结果表明，苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对巨噬细胞不产生毒性，但呈剂量依赖性显著降低过氧化氢（H2O2）诱导巨噬细胞的NO水平（p＜0.05），并且显著提高过氧化氢诱导巨噬细胞的IL-6水平（p＜0.05）和TNF-α水平（p＜0.05）。苦丁茶甲醇提取物和绿原酸可降低巨噬细胞的NO来减少其氧化应激，但对过氧化氢诱导巨噬细胞的IL-6和TNF-α显著提高，似乎与过氧化氢一起促进其细胞凋亡。苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对巨噬细胞的影响较为复杂，需要进行更进一步研究。

苦丁茶；绿原酸；巨噬细胞；细胞凋亡

当机体发生应激时会产生过量的活性氧，活性氧的清除不足会产生大量自由基，导致细胞的氧化性损伤，影响细胞的正常生理功能。近年来，越来越多的植物提取物被认为是外源性的天然自由基清除剂，并开展了各种清除自由基的试验研究[1]。苦丁茶主要分布于我国南方，性凉、味苦微甘，清热解毒，治火眼、口疳、乳痈、肿毒、烫伤，具有清凉解热、利尿等疗效，在民间作为一种保健饮料已有2 000年的历史。现有的植物化学分析结果表明，苦丁茶富含绿原酸，具有明显的消炎镇痛、抗氧化作用，可以提高机体免疫力，增强白细胞功能[2]。试验通过苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对过氧化氢诱导巨噬细胞氧化应激的影响，分析其NO，IL-6，TNF-α的水平，为苦丁茶的药理作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦丁茶，老叶烘干后磨粉过筛，甲醇萃取后蒸馏分离，冷冻干燥处理，三蒸水配制的溶液经0.45 μm滤膜过滤后于-20℃保存；绿原酸，SIGMA公司提供；H2O2，广州化学试剂厂提供；NO，IL-6，TNF-α试剂盒，南京建成生物工程研究所提供；MTT，DMSO，Biotopped公司提供；DMEM培养基、胰酶、小牛血清、抗生素，GIBCO公司提供。

1.2 仪器与设备

旋转蒸馏仪、电子天平、6/24/96孔细胞培养板、酶标仪、超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、高速冷冻离心机。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞培养

RAW264.7细胞培养基含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM，并置于细胞培养箱（37℃，5% CO2）。细胞铺满培养皿底70%～80%时，进行传代到第3代，并开始细胞试验。

1.3.2 苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对巨噬细胞存活率的影响

利用不同质量浓度的苦丁茶甲醇提取物（0，200，400，800，1 000 μg/mL）和不同质量浓度的绿原酸（0，5，10，20，40 μg/mL）对RAW264.7细胞进行处理，并把MTT溶液添加到各个处理组，于波长570 nm处测其吸光度。

1.3.3 苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对过氧化氢诱导巨噬细胞的影响

利用不同质量浓度的苦丁茶甲醇提取物（0，200，400，800，1 000 μg/mL）和不同质量浓度的绿原酸（0，5，10，20，40 μg/mL）对RAW264.7细胞预处理12 h，然后用过氧化氢（H2O2，0.12%）诱导4 h，并收集细胞培养液，用试剂盒测定NO含量。

1.3.4 苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对过氧化氢诱导巨噬细胞IL-6和TNF-α的影响

利用不同质量浓度的苦丁茶甲醇提取物（0，200，400，800，1 000 μg/mL）和不同质量浓度的绿原酸（0，5，10，20，40 μg/mL）处理RAW264.7巨噬细胞12 h，然后用H2O2（0.12%）诱导4 h，收集细胞培养液，用试剂盒测定IL-6和TNF-α的水平。

1.4 统计分析

采用SPSS 10.0统计软件对试验数据进行统计学分析，并用GraphPad Prism5作图。p＜0.05为显著性差异，p＜0.01为极显著差异。

2 结果与分析

2.1 苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对巨噬细胞存活率的影响

苦丁茶甲醇提取物对巨噬细胞存活率的影响见图1，绿原酸对巨噬细胞存活率的影响见图2。

图1 苦丁茶甲醇提取物对巨噬细胞存活率的影响

由图1和图2可知，苦丁茶甲醇提取物（0～1 000 μg/mL）和绿原酸（0～40 μg/mL）在设定质量浓度范围内，不影响RAW264.7细胞的存活率，表明苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对细胞不产生毒性。

2.2 苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对过氧化氢诱导巨噬细胞NO的影响

苦丁茶甲醇提取物对H2O2诱导RAW264.7细胞NO的影响见图3，绿原酸对H2O2诱导RAW264.7细胞NO的影响见图4。

图2 绿原酸对巨噬细胞存活率的影响

图3 苦丁茶甲醇提取物对H2O2诱导RAW264.7细胞NO的影响

图4 绿原酸对H2O2诱导RAW264.7细胞NO的影响

由图3和图4可知，苦丁茶甲醇提取物和绿原酸显著降低H2O2诱导RAW264.7细胞的NO含量（p＜0.01），表明苦丁茶甲醇提取物和绿原酸可减少细胞氧化应激。

2.3 苦丁茶甲醇提取物对过氧化氢诱导巨噬细胞IL-6和TNF-α的影响

苦丁茶甲醇提取物对H2O2诱导巨噬细胞IL-6的影响见图5，苦丁茶甲醇提取物对H2O2诱导巨噬细胞TNF-α的影响见图6。

由图5和图6可知，苦丁茶甲醇提取物和绿原酸显著增加H2O2诱导RAW264.7细胞的IL-6和TNF-α（p＜0.01），表明苦丁茶甲醇提取物和绿原酸可促进细胞的凋亡。

图5 苦丁茶甲醇提取物对H2O2诱导巨噬细胞IL-6的影响

图6 苦丁茶甲醇提取物对H2O2诱导巨噬细胞TNF-α的影响

3 讨论与结论

一氧化氮（NO）是具有生物活性的气体分子，是细胞间信息传递的重要调节因子，并介导细胞免疫和炎症的功能，NO的过量生成与炎症的产生具有密切关系。

结果表明，苦丁茶提甲醇取物和绿原酸对RAW 264.7细胞不产生毒性效应，且H2O2诱导的NO释放有抑制作用，呈明显剂量依赖关系。但是，苦丁茶甲醇提取物升高了H2O2诱导RAW264.7细胞的TNF-α和IL-6的水平。卞梦瑶等人发现，生姜油树脂抑制H2O2诱导RAW264.7细胞的NO释放同时，通过显著降低TNF-α和IL-6的水平，降低细胞凋亡来保护细胞。这与试验结果差异较大。苦丁茶甲醇提取物对细胞不具有毒性，而且对NO释放有抑制作用，但在H2O2诱导下反而促进其凋亡[3]，这个过程可能较为复杂，需要进一步的研究。

综上所述，苦丁茶甲醇提取物富含绿原酸，通过抑制NO释放，从氧化应激中保护细胞，为苦丁茶的综合开发利用提供依据。

[1]崔海燕，韩晨露，肖鹏，等.过氧化氢刺激RAW264.7巨噬细胞促炎细胞因子和趋化因子基因表达[J].中国生物化学与分子生物学报，2015，30（7）：734-740.

[2]胡宗福，于文利，赵亚平.绿原酸清除活性氧和抗脂质过氧化的研究[J].食品科学，2006，27（2）：128-130.

[3]李宜培.线粒体损伤与细胞凋亡[J].河南职工医学院学报，2008，20（1）：94-97.◇

Effect of Kudingcha Methanol Extract on Hydrogen Peroxide Treated Macrophage Cell

ZHONG Tao，*LIU Xiande
（Department of Veterinary Medicine，Hainan University，Haikou，Hainan 570228，China）

The macrophage cell（RAW264.7）is induced to oxidation stress model by hydrogen peroxide and detected NO，IL-6，and TNF-α after treating of Kudingcha methanol extract and chlorogenic acid.The results show that Kudingcha methanol extract and chlorogenic acid did not affect macrophage cell viability and，dose dependently decreased NO production and increased IL-6 and TNF-α in hydrogen peroxide treated macrophage cell（p＜0.05）.Kudingcha methanol extract and chlorogenic acid decreased oxidation stress via NO reduction，but seem to promoted cell apoptosis with increasing of IL-6 and TNF-α in hydrogen peroxide treated macrophage cell.Therefore，effect of Kudingcha methanol extract and chlorogenic acid on hydrogen peroxide treated macrophage cell，that is very complicated and need further study.

Kudingcha；chlorogenic acid；macrophage cell；apoptosis

R285

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.003

1671-9646（2017）05a-0007-03

2017-04-22

海南省社会发展科技专项（SF201421）；海南省应用技术研发与示范推广专项（ZDXM2015065）。

钟韬（1992—），男，在读硕士，研究方向为动物遗传育种。

*通讯作者：柳贤德（1979—），男，博士，副教授，研究方向为兽医公共卫生的教学与科研。