NOX通路在氧化应激诱导的宫颈癌细胞凋亡中的作用

王井，汪洪涛，马华，孙美群，赵卫东

(1安徽医科大学附属省立医院，合肥 230001;2 蚌埠医学院)

NOX通路在氧化应激诱导的宫颈癌细胞凋亡中的作用

王井1，汪洪涛2，马华2，孙美群2，赵卫东1

(1安徽医科大学附属省立医院，合肥 230001;2 蚌埠医学院)

目的 探讨烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)通路在氧化应激诱导的宫颈癌细胞凋亡中的作用。方法 流式细胞术检测不同类型宫颈癌细胞内在的总活性氧(ROS)水平及NOX途径抑制剂DPI处理前后不同类型宫颈癌细胞内线粒体途径和NOX途径ROS水平；DPI预处理、H2O2作用后采用流式细胞术检测不同类型宫颈癌细胞凋亡率。结果 人乳头瘤病毒(HPV)阳性宫颈癌细胞内在ROS水平明显高于HPV阴性宫颈癌细胞(P<0.05)，两类宫颈癌细胞线粒体途径来源ROS水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。与预处理前比较，DPI预处理后HPV阳性宫颈癌细胞内在ROS水平均明显降低(P均<0.05)。与诱导前及HPV阴性宫颈癌细胞比较，H2O2诱导后HPV阳性宫颈癌细胞凋亡率均明显升高，且高于DPI预处理及DPI预处理+H2O2诱导细胞(P均<0.05)。结论 NOX通路在HPV感染导致宫颈癌的过程中具有重要作用，促氧化治疗可能更好地杀伤HPV阳性宫颈癌细胞。

宫颈癌；人乳头瘤病毒；氧化应激；活性氧；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶

宫颈癌在全球妇女癌症病死率中位居第二，仅次于乳腺癌，在一些发展中国家甚至居于首位，并具有年轻化趋势；全球每年大约有50万妇女发病，我国每年有13～15万新发宫颈癌病例，占全球新发病例的1/3，严重威胁着广大妇女的健康和生命[1]。人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要致病因子，宫颈上皮组织暴露与氧化应激，促进了病毒的持续和慢性感染。在宿主细胞中病毒基因组的整合产生遗传重排，基因组不稳定，导致致瘤转化的风险增加[2,3]。研究表明，HPV阳性宫颈癌细胞比HPV阴性宫颈癌细胞对化疗和放疗有更好的反应性[4,5]，化疗和放疗主要通过产生高浓度活性氧(ROS)引起细胞凋亡。因此，阐明ROS的分子信号机制，有助于我们理解HPV致病机制及优化治疗HPV相关肿瘤的策略。2015年8月～2016年8月我们进行了如下研究，旨在探讨不同类型宫颈癌细胞的氧化应激状态，以及NOX通路在氧化应激诱导的宫颈癌细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞系：HPV-16阳性细胞株(SiHa、CaSki)，HPV-18阳性细胞株(HeLa、C4-I)，HPV阴性细胞株(C33A细胞)；其中SiHa、CaSki、HeLa、C33A细胞株均购自中国科学院北京协和细胞库，C4-I由西安交通大学第一附属医院科研中心提供。主要试剂及仪器：DMEM，MEM培养基，FBS(Gibco)；DCHF-DA分子探针(Sigma)，线粒体特异性超氧化物分子探针MitSox(Invitrogen)，diphenyleneiodonium chloride (DPI, Sigma)；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit (碧云天)，FACSCalibur 流式细胞仪(BD)。

1.2 细胞培养 C33A细胞使用含10% FBS的MEM培养基培养，其他宫颈癌细胞均使用含10% FBS的DMEM培养基培养，每1 mL培养液中含青、链霉素各100 U，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。每天或隔天进行换液，2～3天传代一次，每次实验使用对数生长期的细胞。

1.3 宫颈癌细胞基础ROS水平检测 取对数生长期的宫颈癌细胞，胰酶消化处理，完全培养液重悬细胞制备成2×105个/mL的细胞悬液，接种于6孔板，2 mL/孔，置37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，24 h后弃去培养基，更换用无血清培养基稀释的DCFH-DA(终浓度为10 μmol/L)，200 μL/孔，37 ℃细胞培养箱内孵育30 min。用无血清培养基洗涤细胞3次(以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA)。消化，收集细胞，流式细胞术检测。ROS水平以平均荧光强度(MFI)表示。

1.4 DPI处理前后不同宫颈癌细胞内总ROS及线粒体途径ROS水平检测 取对数生长期的宫颈癌细胞，胰酶消化处理，完全培养液重悬细胞制备成2×105个/mL的细胞悬液，接种于6孔板，2 mL/孔，置37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，24 h后弃去培养基，加入用无血清培养基稀释的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)途径特异性抑制剂DPI(终浓度1 μmol/L)，作用60 min。负载探针MitoSox (终浓度5 μmol/L)，37 ℃细胞培养箱内孵育30 min。消化，收集细胞，流式细胞术检测。ROS水平以MFI表示。

1.5 H2O2诱导前后不同宫颈癌细胞内ROS水平及细胞凋亡率检测 取对数生长期的宫颈癌细胞，胰酶消化处理，完全培养液重悬细胞制备成2×105个/mL的细胞悬液，接种于6孔板，2 mL/孔，置37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，细胞铺满70%～80%瓶底，DPI预处理1 h(终浓度1 μmol/L)或不处理，更换含100 μmol/L H2O2的完全培养基作用6 h(H2O2浓度和作用时间通过预实验确定)，消化，收集细胞，Annexin V-FITC/PI双染，流式细胞术检测各组细胞凋亡率。ROS水平检测方法同1.3。

2 结果

2.1 不同类型宫颈癌细胞内ROS水平比较 HPV阳性宫颈癌细胞内基础ROS水平为46 000±285(SiHa、CaSki、HeLa、C4-1分别为46 145±288、45 832±279、44 731±266、45 175±274)，HPV阴性宫颈癌细胞C33A为4 200±62，二者比较P<0.05。

2.2 DPI处理前后不同宫颈癌细胞内总ROS及线粒体途径ROS水平比较 不同类型宫颈癌细胞线粒体水平来源ROS水平比较无明显差异(P>0.05)。DPI处理后HPV阳性宫颈癌细胞株细胞内ROS水平明显降低(P<0.05)，而线粒体途径超氧化物水平比较无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1 DPI处理前后不同宫颈癌细胞内总ROS及线粒体途径ROS水平比较

注：与DPI处理前比较，*P<0.05。

2.3 H2O2诱导前后不同宫颈癌细胞内ROS水平变化及细胞凋亡 H2O2诱导不同宫颈癌细胞后，细胞内总ROS水平均明显升高(P均<0.05)，并促进细胞凋亡(P均<0.05)；与HPV阴性宫颈癌细胞相比，HPV阳性宫颈癌细胞凋亡率明显增加(P<0.01)；NOX途径抑制剂DPI预处理后，能明显降低H2O2诱导的HPV阳性宫颈癌细胞凋亡(P<0.05)。见表2、3。

表2 H2O2诱导前后不同宫颈癌细胞内ROS水平比较

注：与H2O2诱导前比较，*P<0.05。

表3 H2O2诱导及NOX途径抑制剂DPI预处理后宫颈癌细胞凋亡情况

注：与H2O2诱导前比较，*P<0.05，△P<0.01；与C33A细胞同时间点比较，#P<0.01；与H2O2诱导后比较，▲P<0.05。

3 讨论

在活细胞中，内源性ROS是新陈代谢的副产物，大部分内源性的活性氧产生于线粒体电子传递链[5～8]。ROS也可以来源于内外源性刺激，如UV辐射，射线辐射及化学药物等刺激，通过NOX途径产生[9]。在所有需氧细胞，ROS和抗氧化物质处于一种生理平衡状态，一旦这种平衡被打破，发生氧化应激，ROS产生增加。ROS产生氧化应激会通过脂质过氧化，DNA损伤和蛋白质破坏，促进正常细胞转化为肿瘤细胞[10,12]。ROS也可促进肿瘤细胞增殖和迁移[13～15]，因此长期以来ROS被认为是肿瘤发生、发展和复发的重要因素。然而，近年来对ROS的研究发现，机体可以利用ROS控制癌细胞的生长，抑制肿瘤细胞的迁移[16～18]，所以细胞的氧化还原状态很可能成为潜在的治疗靶标。

高危型HPV感染与宫颈癌关系密切，其中HPV16和HPV18是最常见的两种类型[6]。很多研究表明，HPV阳性宫颈癌细胞比HPV阴性宫颈癌细胞对化疗和放疗有更好的反应性[4,5]。为了探讨氧化应激与HPV是否存在一定的关联，我们分别选取了HPV16阳性、HPV18阳性及HPV阴性宫颈癌细胞作为研究对象，利用DCHF-DA分子探针检测这些癌细胞内ROS水平。本研究结果表明，HPV阳性宫颈癌细胞的胞内ROS水平明显高于HPV阴性宫颈癌细胞，与Marullo等[19]在HPV相关头颈癌细胞的研究结果类似。Marullo等[19]研究结果显示HPV相关头颈癌细胞内ROS的升高与致瘤蛋白HPV E6/E7的作用有关。HPV阳性宫颈癌细胞内高水平的ROS暗示其胞内抗氧化系统存在缺陷，放化疗治疗通常可引起氧化应激产生大量ROS，导致细胞毒害作用，引起肿瘤细胞死亡。HPV阳性宫颈癌细胞对放化疗比HPV阴性细胞敏感可能与宫颈癌细胞的氧化应激状态有关。ROS有两种主要途径：线粒体途径和NOX途径。我们研究发现，NOX途径是HPV阳性宫颈癌细胞ROS产生的主要来源，NADPH氧化酶最早发现于中性粒细胞和巨噬细胞内，因此又称呼吸爆发氧化酶或巨噬细胞氧化酶，在先天性免疫系统中发挥重要作用。吞噬细胞NADPH氧化酶生成的ROS主要起细胞防御功能，而非吞噬细胞中NADPH氧化酶产生的ROS通常作为信号分子，参与机体内信号转导，调节细胞分化、增殖、衰老和凋亡等。大量研究证明肿瘤细胞内具有比正常细胞较高的ROS，来帮助维系其异常增殖[20～22]。

子宫颈处于特殊位置，接触和遭受病毒感染机会大。但并不是所有感染HPV的患者都最终发展成为宫颈癌，因此推测其他因素参与了宫颈癌的发生。病毒感染可引起人体广泛的氧化应激反应，使局部组织的ROS水平持续升高，进一步促进病毒的损伤作用及病毒基因组整合到宿主细胞，导致肿瘤的发生。有人提出使用抗氧化剂治疗肿瘤，但许多抗氧化剂不但没有抗肿瘤作用，反而促进肿瘤的发生和转移[16～18]；而促氧化治疗药物却取得了很好的治疗作用，化疗和放疗主要通过产生高浓度ROS杀死肿瘤细胞。目前，增加肿瘤细胞内ROS水平的药物逐渐应用于临床，主要通过增加肿瘤细胞内ROS水平加速肿瘤细胞凋亡从而达到治疗目的。一些研究发现，肿瘤细胞(包括宫颈癌细胞)中ROS和抗氧化物含量均较高，高水平抗氧化物是肿瘤细胞用于抑制高水平的氧化物维持其生长的防御屏障，能提高其抗氧化应激损伤能力[23,24]。本研究结果显示，H2O2诱导的氧化应激可促进肿瘤细胞凋亡，使用NOX途径特异性抑制剂可明显降低HPV阳性宫颈癌细胞的凋亡率。因此，抗氧化治疗可能导致肿瘤细胞受益要多于正常细胞，甚至会加速肿瘤的生长和转移。增加肿瘤细胞内氧化物水平，降低抗氧化物质表达，使肿瘤细胞抗氧化应激能力下降，可能提高放化疗的效果。

综上所述，不同类型的宫颈癌细胞氧化应激状态不同，HPV阳性宫颈癌细胞内ROS水平高于阴性宫颈癌细胞。NOX途径是HPV阳性宫颈癌细胞ROS的主要来源，促氧化治疗可能更好地杀伤HPV阳性宫颈癌细胞，为宫颈癌及HPV相关肿瘤的治疗提供新靶标。

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Effect of NOX pathway in oxidative stress-induced apoptosis of cervical cancer cells

WANGJing1,WANGHongtao,MAHua,SUNMeiqun,ZHAOWeidong

(1AnhuiProvincialHospital,Hefei230001,China)

ObjectiveTo investigate the oxidative stress status of different types of cervical cancer cells, and the role of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NOX) pathway in oxidative stress-induced apoptosis of cervical cancer cells.MethodsFlow cytometry (FCM) was employed to detect the levels of total reactive oxygen species (ROS) of different types of cervical cancer cells and intracellular ROS levels derived from mitochondrial and NOX pathway before and after treatment with a NOX inhibitor, DPI. After DPI pretreatment and H2O2action, flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of different types of cervical cancer cells.ResultsHPV-positive cells showed higher levels of ROS as compared with HPV-negative cells (P<0.05). No significant difference was found in the mitochondrial pathway-derived ROS level between HPV-negative cells and HPV-positive cells (P>0.05). NOX inhibitor DPI significantly reduced ROS level in HPV-positive cells as compared with that before treatment (P<0.05). Compared with the control group and the HPV-negative cells, the apoptosis rate of HPV-positive cells increased after H2O2induction and was higher than that of HPV-positive cells group with DPI pretreatment and with DPI pretreatment + H2O2induction.ConclusionNOX pathway plays an important role in the process of HPV inducing cervical cancer, and pro-oxidant treatment may be more effective in killing HPV-positive cervical cancer cells.

cervical carcinoma; human papilloma virus; stress; reactive oxygen species; nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase

安徽高校自然科学基金重点项目(KJ2016A472)。

王井(1983-)，女，本科，主治医师，主要研究方向为肿瘤免疫。E-mail： 119877366@qq.com

赵卫东(1970-)，男，博士，主任医师，博士生导师，主要研究方向为妇科肿瘤。E-mail： victorzhao@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.004

R737.33

A

1002-266X(2017)20-0013-04

2016-09-06)