神经干细胞和多巴胺神经元联合移植对帕金森病大鼠运动障碍的影响

李智高，徐蛟天，陈孝祥，林海，宋晓斌，杨智勇，邓兴力

(昆明医科大学第一附属医院，昆明650032)

神经干细胞和多巴胺神经元联合移植对帕金森病大鼠运动障碍的影响

李智高，徐蛟天，陈孝祥，林海，宋晓斌，杨智勇，邓兴力

(昆明医科大学第一附属医院，昆明650032)

目的 探讨神经干细胞和多巴胺神经元联合移植改善帕金森病大鼠运动障碍的效果。方法 采用经典6-羟基多巴胺毁损法构建帕金森病大鼠模型36只，腹腔注射阿朴吗啡连续诱导4周。APO注射第4周将36只帕金森病大鼠随机分为对照组、多巴胺组、干细胞组及联合组，每组9只，分别于右侧纹状体区立体定向注入生理盐水、多巴胺神经元悬液、神经干细胞悬液、多巴胺神经元与神经干细胞悬液。计算各组移植后2、4、6、8周的旋转次数；干细胞组及联合组分别于移植后1、2、4、8周行MRI扫描，观察移植区影像学变化；移植后8周取各组脑组织行普鲁士蓝染色，观察移植细胞定植与迁移情况，免疫荧光法检测移植细胞分化情况。结果 移植后2、4、6、8 周，对照组、神经干细胞组、多巴胺组、联合组旋转次数依次降低，组间两两比较P均<0.01。MRI检查结果：随着时间延长，联合组与干细胞组移植区T2 W/FFE成像上呈低信号影的区域逐渐变大，但联合组低信号影范围大于干细胞组。普鲁士蓝染色结果：干细胞组和联合组移植的神经干细胞及其分化后的细胞胞质内均可见大量蓝色颗粒，大部分存留在移植针孔附近，仅少部分细胞向远处迁移，但联合组蓝色颗粒数量以及扩散范围均大于干细胞组。联合组巢蛋白(Nestin)、酪氨酸羟化酶(TH)、绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞数及Nestin/GFP、TH/GFP均高于干细胞组，酸性纤维蛋白(GFAP)阳性细胞数及GFAP/GFP均低于干细胞组(P均<0.01)。结论 神经干细胞与多巴胺神经元联合移植可显著改善帕金森病大鼠的运动障碍，更有助于神经干细胞的定植、迁移及分化成为多巴胺神经元。

帕金森病；神经干细胞；多巴胺神经元；神经干细胞移植；神经元移植

帕金森病是一种与多巴胺神经元变性缺失相关的神经退行性疾病，最终引起一系列运动障碍症状，目前尚无根治的方法[1]。随着对帕金森病研究的深入，以替代和补充变性缺失的多巴胺神经元来实现神经元修复和功能重塑，在帕金森病治疗中具有巨大的潜在应用价值[2]。绿色荧光蛋白(GFP)基因标记技术是一种新型的细胞示踪技术，用其标记神经干细胞可稳定表达GFP，具有敏感性强、存在时间久、不影响细胞功能等特点[3]。超顺磁氧化铁(SPIO)是一种新型MRI对比剂，用其标记的神经干细胞可在移植后不同时间点采用MRI动态观察移植细胞的存活、分化以及迁移情况[4]。 2015年9月～2016年9月，本研究观察了GFP、SPIO双标神经干细胞联合多巴胺神经元移植对帕金森病大鼠运动障碍的改善作用及移植后神经干细胞的迁移及分化情况，旨在为细胞替代疗法治疗帕金森病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠36只，SPF级，体质量180～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。主要试剂及仪器：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、Alex-Fluor 594羊抗兔IgG及酸性纤维蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)、β-3-tubulin多克隆抗体均购自美国Proteintech公司，FBS、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自碧云天生物技术研究所；大鼠脑三维立体定向仪(美国Stoelting公司)。

1.2 神经干细胞和多巴胺神经元建立

1.2.1 大鼠胚胎中脑神经干细胞分离及鉴定 取孕12.5天的SD大鼠1只，无菌条件下取出胚胎中脑组织并剪碎，吹打后200目筛网过滤，1 000 r/min离心5 min，取细胞悬液并调整细胞密度为1×105个/mL，接种于培养瓶。37 ℃、5% CO2条件下采用神经干细胞培养液进行培养， 神经干细胞培养液：含1% N2的DMEM/F12培养基、bFGF(20 μg/L)、EGF(20 μg/L)、1%双抗。高倍镜(×200)下观察细胞生长情况，结果显示细胞形成神经球，悬浮生长，球中心较暗，周边折光率较强，未见突起。根据细胞代谢情况每2～3天半量加液，取培养5天的细胞，采用免疫细胞化学法检测神经干细胞标志物巢蛋白(Nestin)的表达情况，结果显示Nestin表达呈阳性。将细胞经血清诱导分化培养3天，神经球贴壁并呈分化生长，采用免疫细胞化学法检测神经元特异性标志物β-3-tubulin、神经胶质细胞特异性标志物GFAP和多巴胺神经元特异性标志物TH的表达，二抗分别为Alex-Fluor594、Alex-Fluor594、FITC羊抗兔IgG，严格按照试剂盒说明书进行操作。结果显示分化后存在以下细胞：呈多角形、有单个或多个突起、GFAP阳性的星形胶质样细胞；细胞体较大、有轴突和数个短小突起、β-3-tubulin阳性的神经元；细胞体呈梭形或椎体形、发出单个或多个突起、TH阳性的神经元。以上均证实分离出的细胞为神经干细胞。

1.2.2 SPIO、GFP双标神经干细胞建立 参考前期研究方法[5]，建立SPIO、GFP双标神经干细胞。

1.2.3 多巴胺神经元分离及标记 参考前期研究方法[6]，分离培养并鉴定多巴胺神经元，以CM-DiI进行标记。结果证实多巴胺神经元纯度>90%并用于以下试验。

1.3 帕金森病模型建立 取36只SD大鼠，以经典6-羟基多巴胺(6-OHDA)毁损法为基础[7]，改进毁损位点建立帕金森病模型。方法如下：将大鼠以7%水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔注射麻醉，以前囟为基准点，分别于右侧内侧前脑束(A/P：-3.6 mm；L：+2.0 mm；V：-8.5 mm)及纹状体(A/P：+0.4.0 mm；L：+2.0 mm；V：-5.0 mm)注射15 μg 6-OHDA(3 μg/μL)，术后1周腹腔注射阿朴吗啡(APO)0.40 mg/kg诱发大鼠做偏侧旋转运动，每周1次，连续诱导4周，观察大鼠行为学改变。结果显示部分大鼠术后1周开始出现运动迟滞、四肢震颤等运动障碍；术后2周开始出现向健侧异常旋转运动。随着时间推移，旋转动物数量、旋转圈数均逐渐递增，术后4周，趋于稳定。每只大鼠术后第4周注射APO 5 min后，计数10 min内的旋转情况及旋转次数，以平均向健侧(左侧)旋转速度>7 r/min定义为模型建立成功。结果显示，36只大鼠恒定向健侧旋转运动，且旋转速度>7 r/min，证实建模成功并用于后续实验。

1.4 神经干细胞和多巴胺神经元联合移植对SD大鼠运动障碍改善作用的观察

1.4.1 分组处理 采用随机数字表法将36只帕金森病模型大鼠随机分为对照组、多巴胺组、神经干细胞组(干细胞组)、联合组，每组9只。多巴胺组、干细胞组分别将5 μL 多巴胺神经元及SPIO、GFP双标神经干细胞细胞悬液(均含5×105个细胞)立体定向注入右侧纹状体区(A/P：+0.5 mm；L：+2.0 mm；V：-5.0 mm)。联合组将多巴胺神经元与SPIO、GFP双标神经干细胞按1∶2的比例进行配比，参照上述方法注入右侧纹状体区。对照组右侧纹状体区注射等体积生理盐水。

1.4.2 运动功能改善情况观察 记录各组移植前及移植后第2、4、6、8周APO诱导后10 min内的旋转次数，以移植后旋转次数/移植前旋转次数计算移植后2、4、6、8周的旋转次数相对比，比值越低说明治疗效果越好。

1.5 神经干细胞移植后的定植、迁移与分化观察

1.5.1 神经干细胞移植后的定植与迁移 ①MRI扫描。将干细胞组、联合组分别于移植后1、2、4、8周进行MRI扫描，采用5英寸表面线圈，先进行三平面定位扫描，再行梯度回波T2加权(T2 W/FFE)成像。设置参数：TR 388 ms，TE 23 ms，翻转角18°，FOV 120 mm，矩阵205×256，层厚 2.0 mm，扫描时间2 min 8 s。观察各组移植区SPIO标记神经干细胞定植、迁移情况。②普鲁士蓝染色。移植8周后干细胞组、联合组常规采用生理盐水及4%多聚甲醛进行心脏灌注，处死后开颅，取脑组织，用4%多聚甲醛固定，蔗糖梯度脱水，OTC包埋剂包埋，移植点连续10 μm厚度冰冻切片。脑组织切片行普鲁士蓝染色。200倍显微镜下观察染色情况，以此反映SPIO标记神经干细胞的定植、迁移情况。

1.5.2 神经干细胞移植后的分化 采用免疫荧光法。取1.5.1中干细胞组、联合组的脑组织切片，封片后10%山羊血清封闭，加入一抗(Nestin 1∶800、TH 1∶800、GFAP 1∶500)冷藏孵育过夜，次日漂洗后添加IgG荧光二抗(Alex-Fluor594羊抗兔IgG，稀释倍数为1∶200)，避光孵育，封片剂封片后在激光共聚焦显微镜下观察拍照。200倍视野下，连续对5张组织切片移植点处的Nestin、TH、GFAP及GFP阳性细胞进行计数，取平均值。计算Nestin、TH、GFAP阳性细胞数占GFP阳性细胞数的百分比，分别记为Nestin/GFP、TH/GFP、GFAP/GFP，比值越大说明移植神经干细胞的分化率越高。

2 结果

2.1 各组运动障碍改善情况 见表1。

表1 各组旋转次数相对比比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与多巴胺组比较，#P<0.01；与干细胞组比较，△P<0.01。

2.2 神经干细胞移植的定植与迁移情况 MRI检查结果显示：移植1周后，联合组与干细胞组T2 W/FFE成像均可见细胞移植区呈类圆形低信号影，大部分细胞聚集在移植点附近；随着时间延长，两组移植区T2 W/FFE成像上仍呈低信号影，且区域逐渐变大，但联合组的低信号影范围大于干细胞组。普鲁士蓝染色结果显示：移植8周，联合组与干细胞组移植的神经干细胞及其分化后的细胞胞质内均可见大量蓝色颗粒，大部分存留在移植针孔附近，仅有少数部分细胞向远处迁移；但联合组蓝色颗粒数量以及扩散范围均大于干细胞组。

2.3 神经干细胞的分化情况 见表2、3。

表2 干细胞组与联合组脑组织阳性细胞计数比较(个

注：与干细胞组比较，*P<0.01。

3 讨论

移植胚胎多巴胺神经元可提高局部多巴胺水平，从而显著改善帕金森病动物模型的症状[8]，但是移植后多巴胺神经元的存活数量以及生存时间仍有待提高。神经干细胞存在于幼年及成年哺乳动物的中枢神经系统内神经发生相关区域，特别是脑室下区(SVZ)、齿状回的粒下层(SGZ)[9]。作为多种细胞的祖细胞，神经干细胞的增殖和分化能力受到多种因素的调节，其中一些神经元对神经干细胞分化的方向也有至关重要的影响[10]。国内研究证实，胚胎中脑多巴胺神经元与诱导神经干细胞分化移植治疗帕金森病大鼠均具有显著疗效，但同样都面临神经干细胞向多巴胺神经元分化率较低的困境[11]。故本研究在此基础上联合原代培养的神经干细胞和多巴胺神经元共移植治疗帕金森病，以期待实现更好的治疗效果。本研究结果显示，移植后2、4、6、8 周，干细胞组旋转次数高于多巴胺组，说明移植神经干细胞治疗运动障碍的帕金森病疗效不如移植多巴胺；这是由于神经干细胞本身是一种前体细胞，分化成为多巴胺神经元才能发挥作用。本研究中，联合组移植后2、4、6、8 周旋转次数相对比均低于其他组，可能是由于神经干细胞可定向分化成为多巴胺神经元，其移植后一方面增加了多巴胺神经元的数量，另一方面可能通过刺激因子作用分化成为不同神经元的同时，分泌多种神经营养因子，从而更有利于多巴胺神经元的存活。

表3 干细胞组与联合组脑组织Nestin/GFP、TH/GFP、GFAP/GFP比较

注：与干细胞组比较，*P<0.01。

SPIO是一种组织特异性磁共振对比剂，具有超顺磁性。SPIO颗粒分布于组织后可扰乱内部磁场，引起质子自旋快速失相位，从而缩短组织的T2和T1值，特别是T2值的缩短更明显，故可采用T2 FFE观察SPIO标记神经干细胞移植后的定植和迁移情况[12]。动态MRI扫描能提供近细胞级分辨率的图像和整体影像，分辨率、敏感度均较高。通过MRI示踪SPIO标记的神经干细胞，能够在活体上进行直观追踪，从而了解其在大鼠脑内的分布、迁徙、分化情况，有助于临床上进行移植治疗后的在体疗效观察和功能恢复评估。GFP基因标记技术具有高效、稳定的特点，可在活细胞稳定表达且易于检测。本研究中SPIO、GFP双标NSC，相对于单标可以更加直观有效地实现对移植活细胞实时定位的追踪和观察。CM-DiI是一种无细胞毒性的荧光染料，不影响细胞的生长，适合标记和示踪细胞，故本研究采用CM-DiI对多巴胺神经元进行标记；MRI检查结果显示，联合组停留在移植原位的细胞随着移植时间延长逐渐向移植点周围扩散，扩散范围大于干细胞组；普鲁士蓝染色显示，联合组相较干细胞组也有上述趋势。以上均说明，联合移植相对于单独神经干细胞移植细胞存活数量更多，细胞迁移的范围更广。本研究联合组Nestin、TH、GFP阳性细胞数及Nestin/GFP、TH/GFP均高于干细胞组，GFAP阳性细胞数及GFAP/GFP均低于干细胞组；表明联合移植神经干细胞向多巴胺神经元的分化率高于单独神经干细胞移植，更有利于神经干细胞向多巴胺神经元分化，但是其具体机制有待进一步研究。

综上所述，神经干细胞与多巴胺神经元联合移植可显著改善帕金森病大鼠的运动障碍，更有助于神经干细胞的定植、迁移及分化成为多巴胺神经元。

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Effect of combined transplantation of neural stem cells and dopaminergic neurons on dyskinesia in rats with Parkinson disease

LIZhigao,XUJiaotian,CHENXiaoxiang,LINHai,SONGXiaobin,YANGZhiyong,DENGXingli

(TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China)

ObjectiveTo explore the efficacy of combined transplantation of neural stem cells (NSCs) and dopaminergic (DA) neurons in treatment of dyskinesia in rats with Parkinson disease (PD).MethodsThirty-six rat models with PD were established by using the classical 6-hydrodopamine damage protocol, and followed by 4-week rotation induction via apomorphine (APO) intraperitoneal injection. These 36 PD rats were randomly divided into the following groups after 4 weeks of APO intraperitoneal injection: the control group, the DA neurons group, the NSCs group, and the NSCs-DA group, and normal saline (NS), CM-DiI labeled DA neurons, GFP-SPIO double labeled NSCs, and CM-Dil labeled DA neurons combined with double labeled NSCs neurons were transplanted into the right striatum of these groups by stereotactic injection, respectively. The rotation frequency of these groups was calculated at week 2, 4, 6, and 8 after the transplantation. Moreover, the NSCs group and DA-NSCs group were scanned by MRI at week 1, 2, 4, and 8. The brain tissues of these groups were collected to observe the migration and homing of the transplanted cells after 8 weeks through prussian blue staining, and the differentiation of NSCs was measured by immunofluorescence.ResultsThe rotation frequencies of the control group, the DA neurons group, the NSCs group, and the NSCs-DA group were decreased gradually, and significant difference was found between every two groups, allP<0.01. The results of MRI scan between NSCs group and NSCs-DA group were as following: over the time of transplantation, the hypointense signal area in T2 W/FFE imaging of both groups were larger than before, and the area in the NSCs-DA group was larger than that of the NSCs group. The results of prussian blue staining suggested that there were a lot of blue particles in the cytoplasm of NSCs and its differentiated cells, which were grafted from the NSCs group and NSCs-DA group. However, just a few cells migrated from the transplantation needle core to the distant, but the most of these blue particles were located on the transplantation sites. And the number of the blue particles in the NSCs-DA group was higher, and its diffusion range was larger than that of the NSCs group. Moreover, there were much more Nestin, TH and GFP positive cells in the NSCs-DA group than in the NSCs group, while the GFAP positive cells and the rates of GFAP/GFP were less than those of the NSCs group (allP<0.01).ConclusionThe combined transplantation of NSCs and DA neurons can improve the movement disorder of PD rats significantly, which helps to promote the grafted NSCs homing, migration, and differentiation into DA neurons.

Parkinson disease; neural stem cells; dopaminergic neuron; neural stem cell transplantation; neuron transplantation

国家自然科学基金资助项目(81241126,81360197)；云南省教育厅科学研究基金资助项目(2013C227)；云南省科技厅-昆明医学院联合专项(2014FB041) 。

李智高(1975-)，男，主治医师，主要研究方向为干细胞移植治疗帕金森。E-mail： 459920510@qq.com

邓兴力(1979-)，男，副教授，主要研究方向为干细胞移植治疗帕金森。E-mail： dxlkmmu@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.007

R742.5

A

1002-266X(2017)20-0024-04

2016-10-23)