不同抗肝纤维化方剂薄层色谱和髙效液相色谱保留时间分析

彭巧玲 韩子岩

山西医科大学第二临床医学院消化科 （山西太原，030001）

不同抗肝纤维化方剂薄层色谱和髙效液相色谱保留时间分析

彭巧玲 韩子岩△

山西医科大学第二临床医学院消化科 （山西太原，030001）

目的：对不同抗肝纤维化中药方剂进行成分性质的初探。方法：应用薄层色谱法和高效液相色谱法分析复方861、八味抗纤方、强肝胶囊、扶正化瘀胶囊、化肝纤冲剂、复方鳖甲软肝片的脂溶性／水溶性及成分保留时间。结果：薄层色谱法显示所有方剂水溶性成份显著，仅扶正化瘀胶囊脂溶性成份显著。高效液相色谱显示复方861、八味抗纤方、强肝胶囊、扶正化瘀胶囊、化肝纤冲剂和复方鳖甲软肝片的成分保留时间个数分别是45、37、43、45、25和31，其中相同的保留时间9个。结论：抗肝纤维化方剂以水溶成分为主，方剂成分几十种，少部分重叠；中医中药在抗肝纤维化方面一病多方是可能的。

中药方剂；肝纤维化；薄层色谱；高效液相色谱

中药防治肝纤维化是我国的特色和优势。前期我们已经对国内治疗慢性病毒性肝炎肝纤维化的中药方剂进行了Meta分析，得出复方861、八味抗纤方、扶正化瘀胶囊、化肝纤冲剂、强肝胶囊和复方鳖甲软肝片抗肝纤维化作用显著［1，2］的结论。为进一步比较，我们用薄层色谱对6个方剂的脂溶性及／或水溶性进行初探，用高效液相色谱（HPLC）对成分保留时间进行分析。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 薄层色谱硅胶板G／GF254购自青岛海洋化工厂；Water高效液相色谱仪，包括2489紫外检测器和1525型二元高压梯度泵；液相色谱柱为Symmetry C18柱（5μm，4.6× 250 mm）；ZF-Z型三用紫外仪购自上海市安亭电子仪器厂，BS210S型电子天平购自北京赛多利斯天平有限公司，KQ3200DV型数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试剂 三氯甲烷（20130827，分析纯），乙酸乙酯（20120312，分析纯），甲苯（20110105，分析纯），甲醇1（20140410，分析纯），甲醇2（20150620，色谱纯），乙腈（20150612，色谱纯），甲酸（20130810，分析纯），石油醚（20140311，分析纯），乙醚（20140520，分析纯）。药物：复方861（京药制字Z20063100），强肝胶囊（国药准字Z10980012），扶正化瘀胶囊（国药准字Z20020073），复方鳖甲软肝片（国药准字Z19991011），八味抗纤方（黄芪30g，白术、郁金、陈皮、党参、丹参、黄芩、石菖蒲各12g）和化肝纤冲剂（黄芪30g，三七10g，白芍20g，丹参、莪术、茯苓、海藻、昆布各15g）中每味中药均购自山西医科大学第二医院中药房，由医院中药制剂室煎制、烘干及研粉）。

1.3 试验方法

1.3.1 脂溶性薄层色谱法：参照丹参酮ⅡA薄层色谱方法。经预试验，色谱信息量较大者为供试确定量，复方861粉末15g，余5个方剂粉末各1.0g，分别加乙醚20.0ml，振摇，超声30min，滤过挥干，加乙酸乙酯1ml溶解，作为供试品溶液。吸取供试品溶液各5.0μl，点于硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4：1）为展开剂，于双槽展开箱的一侧加入，预平衡15min，上行展开，展距17cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇，加热至斑点显示清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。

1.3.2 水溶性薄层色谱法：参照丹酚酸B薄层色谱方法。经预试验，色谱信息量较大者为供试确定量，取复方861粉末15g，余5个方剂粉末各2.0g，分别加75%甲醇25.0ml，加热回流1h，滤过，滤液浓缩至1.0ml，作为供试品溶液。吸取供试品溶液各5.0μl，点于硅胶GF254薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2：3：4：0.5：2）为展开剂，于双槽展开箱的一侧加入，预平衡15min，上行展开，展距8cm，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。

1.3.3 高效液相色谱检测法：参照中国药典毛蕊异黄酮葡萄糖苷方法。流速为1m l／min，检测波长260nm，流动相A为乙腈，流动相B为0.2%甲酸溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，超声脱气，备用。流动相梯度洗脱程序：时间0～20min，20～40%流动相A和80～60%流动相B；时间20～30min，40%流动相A和60%流动相B。称取煎剂粉末各1.0g，复方861粉末15.0g，余成药粉末各2.0g，于圆底烧瓶中精密加入纯甲醇50ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25.0ml至干，再加甲醇溶解至5ml量瓶中，摇匀，即得供试品溶液。供试品溶液各10μl注入液相色谱仪；重复测定两次，色谱峰保留时间重现性稳定。

2 结果

2.1 不同抗肝纤维化方剂薄层色谱法试验结果 脂溶性方法薄层色谱结果显示复方鳖甲软肝片脂溶性成分荧光斑点稀少；复方861、八味抗纤方、强肝胶囊和化肝纤冲剂脂溶性成分斑点缺如；而扶正化瘀胶囊脂溶性成分荧光斑点显著（见图1）。

水溶性方法薄层色谱结果显示6种方剂均出现显著水溶性成分斑点，部分呈现重叠。其中扶正化瘀胶囊水溶性成分斑点数目较其他方剂显著（见图2）。（由左至右依次为复方861、八味抗纤方、强肝胶囊、扶正化瘀胶囊、化肝纤冲剂、复方鳖甲软肝片、丹参、黄芪）

图1 各方脂溶性图谱

图2 各方水溶性图谱

2.2 不同抗肝纤维化方剂高效液相色谱法试验结果 6个方剂HPLC指纹图谱见图3～8。HPLC检测报告显示复方861、八味抗纤方、强肝胶囊、扶正化瘀胶囊、化肝纤冲剂和复方鳖甲软肝片的保留时间个数分别是45、37、43、45、25和31，6方剂中9个色谱峰保留时间相同。

图3 复方861指纹图谱

图4 八味抗纤方指纹图谱

图5 强肝胶囊指纹图谱

图6 扶正化瘀胶囊指纹图谱

图7 化肝纤冲剂指纹图谱

图8 复方鳖甲软肝片指纹图谱

3 讨论

中药方剂成分复杂，对其成分探索十分必要。我们前期对国内著名抗肝纤维化方剂做了Meta分析，得出复方861、八味抗纤方、扶正化瘀胶囊、化肝纤冲剂、强肝胶囊和复方鳖甲软肝片在慢性病毒性肝炎抗肝纤维化中作用显著［3～8］的结论。6个抗肝纤维化方剂交集药味是丹参和黄芪，鉴于中国药典黄芪HPLC检测给出了具体的流动相梯度洗脱程序，故，采纳黄芪HPLC方法。本文薄层色谱结果显示6个抗肝纤维化方剂水溶性成分是主要的，仅扶正化瘀胶囊脂溶性成分显著，值得今后研究中关注。HPLC显示的6个方剂间色谱峰保留时间25～45个；6个方剂间有9个色谱峰保留时间相同，提示少部分成分相似或相同；从本次研究结果看，不同成分的方剂具有相同抗肝纤维化药理作用，抗肝纤维化的多靶点效应和中医中药一病多方是有可能的，但是，新的问题又摆在我们面前，少部分相似或相同成分是否承担了君药的作用，几十种成分中，哪些成分是有药理活性作用的，哪些成分是有副作用的，哪些成分是无用的，今后的研究任重道远。

［1］ 郝立然，李娜，李海玲，等.复方中药治疗慢性病毒性肝炎肝纤维化的Meta分析［J］.临床医药实践，2011，20（7）：494－497.

［2］ 李娜，李海玲，郝立然，等.复方中药治疗慢性病毒性肝炎肝纤维化的Meta分析和重要的组分及有效成分［J］.临床医药实践，2012，21（6）：407－416.

［3］ 王宝恩，赵洪涛，王泰玲，等.复方861对肝炎肝纤维化疗效的病理组织学分析［J］.中华肝脏病杂志，1997，5（2）：77－78.

［4］ 刘平，胡义扬，刘成，等.扶正化瘀胶囊干预慢性乙型肝炎肝纤维化作用的多中心临床研究［J］.中西医结合学报，2003，1（2）：89－102.

［5］ 江宇泳，王宪波，王融冰.八味抗纤方治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床研究［J］.北京中医药，2010，29（7）：487－489.

［6］ 杨柳明，徐克成，赵延龙，等.强肝胶囊治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床病理研究［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2001，10（3）：247－249.

［7］ 陈菊梅，杨永平，陈德永，等.复方鳖甲软肝片治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床研究［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2007，21（4）：358－360.

［8］ 胡振斌，石清兰，毛德文，等.化肝纤冲剂抗慢性乙型肝炎肝纤维化疗效观察［J］.辽宁中医杂志，2008，35（4）：556－557.

Analysis of Traditional Chinese M edicine Prescriptions on Anti-liver Fibrosis w ith Thin Layer and High Performance Liquid Chromatography

PENGQiao ling，HAN Zi yan.Digestive Department，The Second Hospital of ShanxiMedical University（Shanxi Taiyuan030001）China

Objective：To discuss the composition properties of Traditional Chinese Medicine（TCM）Prescriptions of anti-liver fibrosis.Methods：Compound 861 Granule，Eight-ingredient Anti-fibrosis Decoction，Qianggan Capsule，Fuzheng Huayu Capsule，Huaganxian Granule and Fufang Biejia Ruangan Tablet were analyzed with thin layer chromatography（TLC）and high performance liquid chromatography（HPLC）.Lipid-solublemethod of tanshinoneⅡA and water-solublemethod of salvianolic acid B were performed on TLC.Calycosin glucoside Method of HPLC was performed.Results：TLC showed that the water soluble components of six prescriptions were significant.The numbers of retention times of six prescriptions of TCM were 45、37、43、45、25 and 31 in above order.The numbers of the same retention timewere nine.Conclusions：Water soluble components are predominant in six TCM prescriptions of anti-liver fibrosis.There are dozens of components and a small number of overlapping of retention time in above TCM.A few of traditional Chinesemedicine prescriptionsmay be used in the same disease with liver fibrosis.

Traditional Chinese Medicine；liver fibrosis；thin layer chromatograph；high performance liquid chromatograph

10.3969／j.issn.1005－0264.2017.02.014

2016－05－08 编辑：吴辉坤）

△通讯作者，E-mail：rweiliaoshi＠126.com