血清中乙型肝炎病毒转录的检测在母婴垂直传播中的临床意义

赵薇

[摘要] 目的 探究血清中乙型肝炎病毒转录的检测在母婴垂直传播中的临床意义。 方法 选择解放军第三〇二医院2014年10月～2016年10月收治的HBV表面抗原（HBsAg）为阳性的40例产妇及其新生儿作为研究对象，按照HBeAg阴性/阳性分为HBeAg阳性组（21例）和HBeAg阴性组（19例），分别抽取2 mL母亲外周血和新生儿脐静脉血，提取RNA，经过逆转录及RT-PCR扩增，得到乙肝病毒DNA（HBx DNA），全长型病毒转录体（fRNA），顿挫型病毒转录体（trRNA），利用琼脂糖凝胶电泳显示出产物。 结果 HBeAg阳性组中母体HBx DNA阳性率和fRNA阳性率明显高于HBeAg阴性组，差异有统计学意义（P < 0.05）。根据母体HBx DNA表型分为HBx DNA阳性组和HBx DNA阴性组。HBx DNA阳性组中母体fRNA阳性率、trRNA阳性率和新生儿trRNA阳性率高于HBx DNA阴性组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 与fRNA、HBx DNA相比，trRNA更早出现在HBV母婴传播过程中，有利于确定新生儿HBV感染情况，具有一定的辅助诊断价值。

[关键词] 乙型肝炎病毒；垂直传播；全长型病毒转录体；顿挫型病毒转录体

[中图分类号] R512.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（c）-0117-04

[Abstract] Objective To explore the clinical significance of the test of serum hepatitis B virus transcription in maternal-infant vertical transmission. Methods From October 2014 to October 2016， 40 maternity patients with positive-HBV surface antigen （HBsAg） and their newborns in 302th Hospital of PLA were selected. All the patients divided into HBeAg positive group （21 cases） and HBeAg negative group （19 cases） according to the HBeAg negative/positive. 2 mL maternal peripheral blood and newborn navel blood were collected， the RNA was extracted， then the HBx DNA， fRNA， trRNA were got through reverse transcription and RT-PCR amplification， the products were showed by agarose gel electrophoresis. Results The positive rates of HBx DNA and fRNA of maternity patients in the HBeAg positive group were higher than those in the HBeAg negative groups， with statistically significant difference （P < 0.05）. Then the cases were divided into HBx DNA positive group and HBx DNA negative group according to the HBx DNA negative/positive. The positive rates of fRNA and trRNA of maternity patients and trRNA of newborns in the HBx DNA positive group were higher than those in the HBx DNA negative groups， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion TrRNA appeared in the process of mother-to-child transmission of HBV is earlier than fRNA， HBx DNA， which is helpful to determine neonatal HBV infection status， and has a certain auxiliary diagnostic value.

[Key words] Hepatitis B virus； Vertical transmission； fRNA； trRNA

乙型肝炎病毒（HBV）在發生慢性感染后可引起患者出现不同程度的肝实质损伤，且绝大多数成年人慢性感染者均为婴幼儿时期感染所致。母婴传播是目前临床上最为常见的最重要的婴幼儿HBV感染途径，母体感染HBV的性质、血清学状态以及HBV病毒载量均于母婴传播的发生密切相关，合并HBV感染阳性的母体可通过宫内感染、产时传播以及产后传播等多种方式造成胎儿以及新生儿的HBV表面抗原（HBsAg）。目前临床上主要以孕晚期感染HBV引起的新生儿感染作为常见，但HBV的母婴传播机制尚未研究清楚[1-2]。由于HBsAg和乙肝病毒DNA（HBx DNA）在新生儿感染早期的检出率较低，且有研究显示，HBV病毒的RNA检出率要明显高于相应的DNA检出率，但仅有部分临床样本中能检测到RNA，在一定程度上限制了RNA在疾病早期辅助诊断中的应用。为了进一步制订有效方法从而阻断HBV母婴传播的途径，本研究针对乙肝病毒转录体中全长型病毒转录体（fRNA），顿挫型病毒转录体（trRNA）在母婴传播中的血清水平进行检测展开研究，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择解放军第三〇二医院（以下简称“我院”）在2014年10月～2016年10月收治的40例HBsAg阳性的产妇及其新生儿作为研究对象，入院分娩的孕妇全部在初检时接受了HBV病毒学检测，HBeAg阴性/阳性分为HBeAg阳性组（21例）和HBeAg阴性组（19例）。新生儿中，男26例，女14例；HBeAg阳性组中，男11例，女10例；HbeAg阴性组中，男15例，女4例。本次试验符合我院医学伦理会的审核，全部患者均签署了关于本次试验的知情权同意书。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

①孕26周时采集孕妇空腹肘部静脉血2 mL，待新生儿分娩后24 h后采集2 mL的股静脉血，静置0.5 h后采用给予低温离心处理，4℃，4000 r/min，离心20 min，将血清分离，按照高纯度病毒核酸提取试剂盒上的操作说明提取核酸。将其中poly（A）RNA替换成为tRNA，作为载体RNA[3]。②对目的核酸进行扩增，设置特异性引物，扩增病毒DNA采用50 μL反应体系，循环条件：93℃ 100 s，90℃ 40 s，58℃ 50 s，70℃ 40 s，35个循环，72℃ 15 min。trRNA、fRNA的RT-PCR系统在逆转录后采用半巢式PCR。PCR产物采用20 g/L琼脂糖凝胶电泳后观察结果。试验所需仪器及试剂盒均由宝生物工程有限公司提供。

1.3 统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件进行分析，计数资料采用χ2检验，以 P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBsAg阳性母体及新生儿血清HBx DNA及RNA检测结果对比

HBeAg阳性组中，母体HBx DNA阳性率和fRNA阳性率均明显高于HBeAg阴性组，差异有统计学意义（P < 0.05）。两组母体及新生儿trRNA阳性率、新生儿HBx DNA阳性率、fRNA阳性率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 不同HBx DNA表型母体与新生儿血清转录体检测结果对比

根据母体HBx DNA表型分为HBx DNA阳性组和HBx DNA阴性组。HBx DNA阳性组中母体fRNA阳性率、trRNA阳性率和新生儿trRNA阳性率高于HBx DNA阴性组，差异有统计学意义（P < 0.05）。两组新生儿fRNA阳性率和HBx DNA阳性率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3 讨论

乙型肝炎作为临床上一类较为常见的疾病，具有较高的发病率，据大量资料显示，HBN在母婴传播中具有较高的比例，所谓母婴传播是指HBsAg阳性的母亲，尤其是伴有HBeAg阳性母亲将HBV传播给胎儿及婴儿，多通过宫内传播、产时传播及产后传播等途径为主，对新生儿造成较大影响，合并HBV感染的孕妇早产率可明显增加，其凝血功能也出现不同程度减退，严重时还可继发胎盘绒毛间隙微血栓形成，使胎盘功能大大减退，明显增加新生儿的窒息率、死胎率以及死亡率，但目前关于HBV母婴传播机制尚未明确[4-5]。随着病毒学以及分子生物学研究的不断深入以及相关科学技术的不断发展，HBV母婴垂直传播的具体作用机制正在不断明确中。早在20世纪80年代国外就有学者在HBsAg阳性孕妇的流产死胎肝细胞中检测到病毒相关抗原的表达以及DNA，提示宫内感染与妊娠结局具有一定的相关关系。有报道指出，通过对新生儿HBV进行早期诊断及检测仍可作为影响及治疗HBV感染的关键与难题，分析其原因是HBsAg及HBx DNA在新生儿感染中具有较低的早期检出率，未能达到令临床工作者满意的目的[6-7]。另有研究资料显示，病毒RNA的检出率相比于对应的DNA检出率较高，主要是指部分样本中仅可诊断出病毒RNA，这表明当机体发生HBV感染后，病毒RNA的检测更加的准确，同时具有更高的灵敏度，可全面地反映出HBV感染状态[8-10]。结合本次试验结果发现，在发生HBV感染后的新生儿血液循环中可出现大量的HBV转录体，作为病毒感染早期的病毒代谢产物，将其作为诊断HBV的早期指标具有重要的意义[11-13]。

有专家学者指出，fRNA与HBx DNA具有密切的相关性，并呈现出正相关关系，可将其作为病毒复制的一个重要指标，其中trRNA可用于标记病毒的持续感染状态，这与本次研究结果基本一致[14-15]。另外，新生儿血清中病毒转录体中几乎均以trRNA存在，这与母体血清中病毒转录体的情况完全不同，说明fRNA的转录以及HBxDNA的复制仍处于未被激活的状态，或正处于某种抑制状态下，随着疾病的进展及感染时间的延长，这些阳性病例即可慢慢进展为显性感染，而另一类的病例则不会出现显性感染，但却可以长时间携带trRNA，并逐年进展成为隐匿性的HBV感染，此时仍需要大量时间进行观察，并引足够的重视[16-18]。对于隐匿性HBV感染患者，患儿体内病毒可能已经全部或大部分被清除，或者仅携带微量的有复制功能缺陷的HBV病毒，从而成为隐匿性感染患者。研究指出，隐匿性感染的发生可能与HBV基因的DNA序列变异以及HBV DNA在宿主細胞染色体中整合作用有关，同时与HBV的外周血单核细胞感染以及相关HBV免疫复合物的形成也具有一定的相关关系。隐匿性感染者的存在具有重要的临床意义，其在免疫抑制的状态下可重新进去疾病的活动期，进展为典型的乙型肝炎，现已成为热议的公众健康问题。

另外，研究中发现，母体自身的免疫功能状态及其血液循环中的HBV病毒载量与HBV的母婴垂直传播的而发生具有影响的相关关系，合并HBV阳性的孕妇，其脐带血的HBx DNA阳性率明显偏高。本研究结果显示，母体为trRNA阳性的新生儿中trRNA的检出率要明显高于母体为trRNA阴性的新生儿，说明母体与新生儿血中trRNA的检出关系更加密切，也一定程度表明受感染的新生儿血中出现的标志物可出现在不同时相中，但仍值得进一步研究与证实[19]。另外，当新生儿血清中存在HBsAg时通常被认为处于一种具有保护作用的状态下，而非完全的非感染状态，结合本次研究结果，可见HBsAg阳性的新生儿中HBxDNA及fRNA检出率要明显低于trRNA[20]。为此，可认为trRNA相比于fRNA、HBxDNA相比，更早出现在HBV母婴传播过程中，有利于确定新生儿HBV感染情况，具有一定的辅助诊断价值。

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（收稿日期：2017-02-16 本文编辑：李岳泽）