AQP3在上皮型卵巢癌细胞卡铂耐药中的作用

潘洁雪+叶龙云

[摘要] 目的 探索上皮型卵巢癌细胞卡铂耐药的机制，为提高卵巢癌患者化疗效果提供前期基础。 方法 应用CCK8方法检测卵巢癌细胞对卡铂的IC50浓度，用Western blot方法检测卡铂处理后细胞上皮间质化转变（EMT）蛋白E-Cadherin和Vimentin表达情况，使用siRNA敲降AQP3后再观察卡铂对其作用。 结果 卵巢癌细胞系SKOV3与A2780的卡铂IC50分别为2.814 μg/mL与1.516 μg/mL，同时发现卡铂能诱导卵巢癌细胞发生EMT，基因芯片结果显示水通道蛋白AQP3显著上调，进一步敲降AQP3基因后，能显著减弱卡铂诱导卵巢癌细胞产生EMT的效果。 结论 AQP3在卵巢癌细胞卡铂耐药机制中具有重要作用，降低AQP3的表达可以减弱卡铂诱导卵巢癌细胞上皮间质化转变的效果。

[关键词] 卵巢癌；卡铂；上皮间质化转变；水通道蛋白

[中圖分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）15-0027-03

[Abstract] Objective To discuss the mechanism of carboplatin resistance in epithelial ovarian cancer cells and to provide basis for improvement of chemotherapy effect in patients with ovarian cancer. Methods The IC50 concentration of ovarian cancer cells towards carboplatin was detected by CCK8， the expression of EMT proteins E-Cadherin and Vimentin after management of carboplatin was detected by Western blot， and the effect of carboplatin was observed again after AQP3 was knocked down by siRNA. Results The carboplatin IC50 was 2.814 μg/mL in SKOV3 ovarian cancer cell line and 1.516 μg/mL in A2780 line. Carboplatin could induce EMT in ovarian cancer cells. As to the result of gene chip， AQP3 was significantly up-regulated. When AQP3 gene was knocked down， EMT effect induced by carboplatin in ovarian cancer cells could be significantly reduced. Conclusion AQP3 has significant effect in the mechanisom of carboplatin resistance in ovarian cancer cells and reduction of the expression of AQP3 can reduce the EMT effect in ovarain cancer cells.

[Key words] Ovarian cancer； Carboplatin； Epithelial-mesenchymal transition； AQP

上皮型卵巢癌是女性生殖器最为常见的恶性肿瘤之一[1]，尽管近年来对卵巢癌的治疗，包括手术、放化疗及靶向治疗已经有了长足的进步，但卵巢癌患者预后仍较差，其中化疗耐药导致卵巢癌患者化疗效果差、早期复发转移是重要因素之一[2]。化疗在卵巢癌患者术后综合治疗中有着举足轻重的地位，铂类为基础的化疗方案是卵巢癌患者的一线治疗方案，但是大多数患者在经历了几个治疗疗程后会产生耐药，尤其是对常用的化疗药卡铂耐药[3]。因而为了进一步提高卵巢癌患者根治术后的生存率，提高现有化疗药物的疗效是治疗关键。但对卡铂化疗耐药更深入的机制仍不清楚，具有局限性，因而进一步研究卵巢癌内在调控化疗耐药的分子信号途径，寻找新的化疗药物，逆转现有的化疗耐药现状为我们制定新的卵巢癌治疗方针提供了重要思路。

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）广泛参与人体细胞内各种生理活动，在细胞膜上广泛分布，在哺乳动物中总共有13种AQP（AQP 0～12）[4]，而其中，AQP3被认为可以使细胞侵袭能力增强[5]，但是在卵巢癌中的研究尚属空白，基于此，本文观察AQP蛋白在卵巢癌中的作用，为进一步解决卡铂耐药奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人卵巢癌细胞株A2780和SKOV3购自中国科学院上海生物科学研究院。使用RPMI-1640培养基，其中胎牛血清浓度为10%、1%青霉素/链霉素，均来自Gibco公司。细胞在37℃和5%CO2的条件下培养。

1.2 细胞活性检测

采用Dojindo公司CCK8试剂盒，检测细胞的活性。将细胞种在96孔培养板后，待细胞贴壁，分别加入指定的卡铂浓度，并培养48 h，加入CCK8试剂，并于490 nm处测OD值。

1.3 Real-time PCR 检测细胞AQP3的表达

分别提取对照组与卡铂组卵巢癌细胞的RNA，采用SYBR Premix Ex Taq Kit （TAKARA公司）进行Real-time PCR 检测AQP3的表达，将目的基因与内参基因的CT值比较（△CT）后，再将卡铂组与对照组比较（△△CT）。

1.4 Western blot检测E-Cadherin、Vimentin、AQP3蛋白水平

RIPA裂解细胞，提取蛋白，使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，随后使用湿转法，将蛋白转到PVDF膜。之后封闭洗过，用E-Cadherin（CST，1∶1000）、Vimentin （CST，1∶1000）、AQP3（Abcam，1∶500）与GAPDH（CST，1∶2000）等一抗4℃过夜。取出膜，使用TBST液洗涤，再使用相应的二抗4℃孵育2 h。使用化学发光法检测印迹。使用Quantity One软件进行条带灰度定量。

1.5基因芯片

将细胞提取RNA送上海康成生物公司，使用Agilent表达谱基因芯片进行分析。

1.6统计学分析

计算和分析使用Graph Pad Prism 6软件，采用两个独立样本均数的t检验进行分析比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌细胞系在卡铂作用下发生EMT

首先检测在SKOV3与A2780两个卵巢癌细胞系中卡铂的IC50，分别为2.814 μg/mL与1.516 μg/mL（封三图1A），发现卡铂细胞显著诱导卵巢癌细胞系EMT，其E-Cadherin蛋白显著下调，而Vimentin蛋白显著上调（封三图1B与封三图1C），灰度定量提示其具有显著统计学差异，因此认为卡铂具有诱导卵巢癌细胞系发生EMT的能力。

2.2 水通道蛋白在卡铂诱导的EMT中的作用

进一步探索水通道蛋白AQP在卡铂作用下卵巢癌细胞系中的作用，使用基因芯片筛查水通道蛋白的变化，发现在水通道蛋白里，AQP 1、6、10、12a基本不变，而AQP 2、9、11表达稍有降低，而AQP 3、4、5、7、8表达上调，在这其中AQP3显著上调（封三图2A）。进一步使用Western blot在蛋白水平确定了AQP3在卡铂作用下的上调趋势（封三图2）。

2.3 敲降AQP3能抑制卡铂诱导的卵巢癌细胞系的EMT作用

进一步使用AQP3 siRNA敲降AQP3在卵巢癌细胞中的表达，并与卡铂联合作用，发现卡铂诱导卵巢癌细胞系形成EMT的作用被AQP3 siRNA明显削弱，卡铂不能诱导卵巢癌细胞系的EMT表型产生，干扰AQP3后，Vimentin表达较卡铂作用显著下降，E-Cadherin则显著上调（封三图3A与封三图3B）。因此推断，卡铂诱导卵巢癌细胞系形成EMT的作用有可能是通过AQP3这条通路。

3讨论

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着女性的生命健康，其在全球女性患者的死亡原因中占第七位[6]。据报道，卵巢癌在美国将近有22 280例的新发病例，以及14 240例的死亡人数[6]，而我国卵巢癌患者的发生率以及死亡率也显著上调，其死亡率达到3.31/10万[7]。卵巢癌患者术后化疗的一线用药以卡铂为基础，铂类药物被广泛用于全身各个脏器的上皮性恶性肿瘤中，包括膀胱癌、睾丸癌、肺癌、卵巢癌、胃癌等[8]。卵巢癌患者化疗耐药导致的术后复发转移与其预后较差相关，因此卵巢癌患者耐药问题亟待解决。

铂类化疗药物耐药涉及多种机制，包括DNA修复系统异常、机体对铂类-DNA复合物的耐药性增强、肿瘤血流异常、铂类药物摄取降低和排出增快、抗凋亡因子上调、肿瘤细胞发生EMT转变，以及多种耐药相关蛋白上调等，而在这其中EMT转变被认为在肿瘤细胞铂类耐药过程中占有重要作用[9-11]。EMT在乳腺癌、肺癌、肠癌与胰腺癌等肿瘤耐药中起重要作用[12-15]。在EMT过程中，肿瘤细胞丧失上皮细胞特点而转向间质性细胞，进而具有更强的侵袭与转移能力，而且具有更强的耐药特性，而其机制尚未明确。本文发现卡铂在处理卵巢癌细胞后发生明显的EMT转变，E-Cadherin表达下调，Vimentin表达上调。

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）广泛分布在机体的细胞膜上，在哺乳动物中总共有13种水通道蛋白（AQP 0～12）[4，16]。AQP3在人体中广泛分布于肾集合管、上皮组织、结膜与乳腺中。据报道AQP3蛋白可以通过对水与甘油的转运从而形成细胞伪足，促进细胞侵袭[17-19]，AQP3缺陷的老鼠可表现为尿液浓缩功能障碍、皮肤愈合功能障碍以及消化道功能异常。而AQP3的功能异常高表达，则有可能促进肿瘤产生与发展[20]。本文从水通道蛋白（AQPs）入手，广泛筛查AQP蛋白在卡铂作用下的耐药特点，进而发现AQP3在卡铂诱导EMT的过程中起重要作用，并且我们进一步敲降AQP3，发现能逆转卡铂引起的EMT过程。

综上，我们认为卡鉑可能是通过AQP3这条通路引起卵巢癌细胞EMT，进而引起卵巢癌细胞耐药，提示AQP3可以作为卵巢癌患者接受卡铂治疗后的预后指标。这些结果可能揭示了一个解决卵巢癌细胞耐药的新通路，为进一步解决这个问题打下了基础，当然需要更进一步的研究揭示AQP3与EMT相关蛋白间具体如何作用。

[参考文献]

[1] Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.Cancer statistics，2011：The impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CA Cancer J Clin，2011，61 （4）：212-236.

[2] Kwon JS，McGahan C，Dehaeck U，et al.The significance of combination chemotherapy in epithelial ovarian cancer[J].Int J Gynecol Cancer，2014，24（2）：226-232.

[3] Jelovac D，Armstrong DK.Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer[J].CA Cancer J Clin，2011，61（3）：183-203.

[4] Nagaraju GP，Basha R，Rajitha B，et al.Aquaporins：Their role in gastrointestinal malignancies[J]. Cancer Lett，2016， 373（1）：12-18.

[5] Hara-Chikuma M，Verkman AS.Prevention of skin tumorigenesis and impairment of epidermal cell proliferation by targeted aquaporin-3 gene disruption[J].Mol Cell Biol，2008，28（1）：326-332.

[6] Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2016[J].CA Cancer J Clin，2016，66（1）：7-30.

[7] 楊念念，严亚琼，龚洁，等.中国2003-2007年卵巢癌发病与死亡分析[J].中国肿瘤，2012，21（6）：401-405.

[8] Choi MK，Kim DD. Platinum transporters and drug resistance[J].Arch Pharm Res，2006，29（12）：1067-1073.

[9] Matsuzaki S，Serada S，Morimoto A，et al. Annexin A4 is a promising therapeutic target for the treatment of platinum-resistant cancers[J]. Expert Opin Ther Targets，2014， 18（4）：403-414.

[10] Dilruba S，Kalayda GV. Platinum-based drugs：Past，present and future[J].Cancer Chemother Pharmacol，2016，77（6）：1103-1124.

[11] Dmitriev OY. Mechanism of tumor resistance to cisplatin mediated by the copper transporter ATP7B[J]. Biochem Cell Biol，2011，89（2）：138-147.

[12] Fischer KR，Durrans A，Lee S，et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is not required for lung metastasis but contributes to chemoresistance[J].Nature，2015，527（7579）：472-476.

[13] Zheng X，Carstens JL，Kim J，et al.Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer[J].Nature，2015，527（7579）：525-530.

[14] Kotiyal S，Bhattacharya S. Breast cancer stem cells，EMT and therapeutic targets[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，453（1）：112-116.

[15] Li C，Ma H，Wang Y，et al.Excess PLAC8 promotes an unconventional ERK2-dependent EMT in colon cancer[J].J Clin Invest，2014，124（5）：2172-2187.

[16] 赵玉荣，赖爱鸾，王丽芳，等.宫颈阴道组织水通道蛋白-2的表达水平及其相关因素研究[J].实用妇产科杂志，2010，1（26）：52-55.

[17] Hara-Chikuma M，Verkman AS.Aquaporin-3 facilitates epidermal cell migration and proliferation during wound healing[J].J Mol Med，2008，86（2）：221-231.

[18] Chen J，Wang Z，Xu D，et al.Aquaporin 3 promotes prostate cancer cell motility and invasion via extracellular signal-regulated kinase 1/2-mediated matrix metalloproteinase-3 secretion[J].Mol Med Rep，2015，11（4）：2882-2888.

[19] Schrader A，Siefken W，Kueper T，et al.Effects of glyceryl glucoside on AQP3 expression，barrier function and hydration of human skin[J]. Skin Pharmacol Physiol，2012， 25（4）：192-199.

[20] Ji C，Cao C，Lu S，et al.Curcumin attenuates EGF-induced AQP3 up-regulation and cell migration in human ovarian cancer cells[J].Cancer Chemoth Pharm，2008，62（5）：857-865.