免疫荧光和几种特殊染色在肾活检病理诊断中的应用*

罗教秀， 储 兵， 曹晓珊， 陈应智， 吴师珍

(中山大学附属中山医院病理科， 广东 中山 528403)

免疫荧光和几种特殊染色在肾活检病理诊断中的应用*

罗教秀， 储 兵*， 曹晓珊， 陈应智， 吴师珍

(中山大学附属中山医院病理科， 广东 中山 528403)

目的：分析免疫荧光染色及其他几种特殊染色法在肾活检病理诊断中的应用效果。方法：临床纳入58例我院2014年9月至2016年9月期间收治的慢性肾脏疾病患者作为研究对象，所有患者均进行肾穿刺活检，穿刺取得组织采用石蜡制片，分别采用免疫荧光法、六胺银染色法、甲醇刚果红染色法、黏蛋白染色法(PAS)以及Masson三色染色，对比不同方法染色的结果。结果：不同类型肾病患者中，免疫荧光染色中狼疮性肾病中IgA、IgM、IgG、C3以及Clq诊断阳性率明显高于IgA肾病和膜性肾病患者，P<0.05。在不同染色方法的对比中发现，免疫荧光染色法在肾病检测IgA、IgM、IgG、C3以及Clq诊断阳性率明显低于其他染色方法的诊断率，P<0.05。其他染色方法诊断率均无差异，P>0.05。结论：免疫荧光染色相对于其他染色方式对肾活检病理诊断率稍低，临床上推荐采用其他特殊染色方法对肾组织进行病理诊断。

免疫荧光； 六胺银； 甲醇刚果红； 黏蛋白染色； Masson三色染色诊断

肾活检组织病理检查包括免疫病理、光学显微镜、电子显微镜等，其中免疫病理检查常采用石蜡切片进行免疫组化染色[1]。虽然临床研究显示冰冻切片相对于石蜡切片来说免疫组化染色敏感性、特异性更高，但由于冰冻切片对温度要求高，且运送条件苛刻，组织不容易保存[2]，本文采用石蜡切片进行免疫荧光染色以及其他几种特殊染色，观察不同染色方法对肾活检组织病理的诊断作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：本次选取58例我院2014年9月至2016年9月期间肾内科收治的慢性肾脏疾病患者作为研究对象，其中男性患者34例，女性患者24例，年龄28～76岁，平均年龄(51.2±4.3)岁。病理类型：IgA肾病患者12例，膜性肾病患者9例，狼疮性肾病患者37例。

1.2 方 法

1.2.1 准备工作：所有患者均采用肾活检进行检查，取肾活检标本脱水、浸蜡等制成石蜡切片，采用10%福尔马林于4℃冰箱中固定24h。 ①玻片：重酪酸清洁液浸泡载玻片24h，自来水洗净后采用蒸馏水浸泡24h，再使用无水酒精浸泡24h，最后捞出烘干，43℃水浴展片，57℃下干燥24h，备用。②配备PBS缓冲液，将PBS粉剂溶于1000mL蒸馏水中，充分搅拌并静置，制成PBS缓冲液。③稀释抗体：5uL抗体加入45uLPBS缓冲液稀释，对抗体IgA、IgM、IgG、C3以及Clq进行检测。④组织脱水包埋切片，免疫荧光1μm厚切片，10张用防脱片剂(多聚赖氨酸)处理过载玻片进行捞片，置60℃烤箱烤片、备用。几种特殊染色2～3μm ，5张用上述处理过的玻片捞片，置60℃烤箱烤片、备用。

1.2.2 免疫荧光染色法：①脱蜡至水：二甲苯进行脱蜡处理，20min/次，进行2次。梯度酒精至水，每个步骤进行5min。②抗原修复：采用由武汉博士德公司生产的柠檬酸(PH为6.0)进行修复，微波热修复，3min中火，停2min，再3min低火。取出切片后自然冷却至室温，采用北京中杉公司生产的胰酶消化，在37℃水浴中恒温放置15min。③滴加抗体：用洁净吸水纸擦去切片组织外蒸馏水，马克笔在载玻片背面圈出组织部分，将50uLFITC标记兔抗人免疫球蛋白抗IgA、IgM、IgG以及补体抗体C3、Clq稀释液滴加至组织上，使抗体稀释液完全覆盖标本组织。④湿盒孵育：滴加了抗体稀释液的切片平放于湿盒中，避光后置于7℃冰箱中过夜孵育，时间为24h。⑤冲洗：孵育后采用PBS冲洗3次，5min/次。甘油封片在荧光显微镜下观察结果。

1.2.3 六胺银染色法:工作液配置：50mL硼砂溶液、六次甲基四胺银粉剂。将硼砂溶液倒入六次甲基四胺银粉剂瓶内，摇匀2min，再将六次甲基四胺银溶液倒入硼砂溶液瓶，重复三次上述步骤，保证粉剂充分溶解，得到工作液。染色步骤：①将工作液放入62℃恒温水浴箱预热。②切片脱蜡至水。③高碘酸溶液氧化标本15min，流水冲洗6遍，5min/遍。④切片放入62℃六胺银工作液中30min，保证温度为62℃恒温，至黄棕色切片出现黑色反应时取出，蒸馏水洗涤后镜下检查。⑤流水冲洗。⑥硫代硫酸钠溶液处理3min，流水冲洗。⑦Mayer苏木素染色细胞核5min。⑧流动自来水冲洗3min并甩干。⑨伊红染液复染1min。⑩梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.4 甲醇刚果红染色法：①石蜡切片常规脱蜡至水。②甲醇刚果红染液染色20min。③碱性酒精分化液分化标本30s。④水洗5min。⑤Mayer苏木素染色细胞核2min，水洗5min。⑥常规脱水透明，中性树胶封固。

1.2.5 黏蛋白染色法(PAS)：①切片脱蜡至水。②蒸馏水洗2min。③高碘酸溶液氧化10min。④充分蒸馏水洗涤，吸水纸吸干。⑤雪夫试剂染色15min。⑥流动自来水冲洗10min。⑦Mayer苏木素染色细胞核5min。⑧流动自来水冲洗3min并甩干。⑨95%乙醇和无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.6 Masson三色染色法：①将切片脱蜡至水后置入Bouin氏固定液中室温过夜(18～24h)。②流水冲洗至切片上的黄色消失。③Weigert铁苏木素染色10min，流水稍洗。④1%盐酸酒精分化，流水冲洗5min。⑤丽春红酸性品红染5min，流水销冲洗。⑥磷钼酸溶液5min，苯胺蓝染液复染5min。⑦1%冰醋酸1min，95%酒精、无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.3 观察指标：观察直接免疫荧光法、六胺银染色法、甲醇刚果红染色法、PAS以及Masson三色染色液染色的结果，判断阳性率情况。阳性判断情况[3]，①免疫荧光法，分为 -、±、+、++、+++、++++，-：阴性，±：低倍镜下不显，高倍镜下似乎可见；+：低倍镜下似乎可见，高倍镜下可见；++：低倍镜下可见，高倍镜下较清晰；+++：低倍镜下较清晰，高倍镜下耀眼；++++：低倍镜下耀眼，高倍镜下刺眼。++及以上为阳性。②六胺银染色：肾小球囊基底膜和肾毛细血管球基底膜呈黑色，细胞核呈蓝色，背景粉红色。③刚果红染色：细胞核呈蓝色，基底膜蓝色，淀粉样物质、红细胞红色，背景淡黄粉色。④PAS染色：细胞核呈蓝色，基底膜呈红色，肾小球系膜基质呈红色。⑤Masson染色：细胞核呈蓝黑色，基底膜，胶原纤维、呈蓝色，免疫复合物呈红色。

1.4 统计学处理:采用SPSS18.0统计软件，计数资料用百分比表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 染色结果:不同类型肾病患者中，免疫荧光染色中狼疮性肾病中IgA、IgM、IgG、C3以及Clq诊断阳性率明显高于IgA肾病和膜性肾病患者，P<0.05。在不同染色方法的对比中发现，免疫荧光染色法在肾病检测IgA、IgM、IgG、C3以及Clq诊断阳性率明显低于其他染色方法的诊断率，P<0.05。其他染色方法诊断率均无差异，P>0.05。见表1。

表1 不同染色方法对肾活检病理诊断情况对比n(%)

注：相同组间对比，*P<0.05；不同染色法对比，#P<0.05

2.2 镜下染色情况

图1 免疫荧光染色

图2 免疫荧光染色

图3 六胺银染色

图4 刚果红染色

图5 Masson染色

图6 PAS染色

图1：IgA沉积在肾小球系膜区，为颗粒状发光物。图2：IgM沉积在肾小球系膜区，为团块状发光物。图3：六胺银染色显示膜性肾病基膜广泛空泡。图4：刚果红染色显示肾小球淀粉样物质阳性，呈砖红色。图5：Masson染色显示玫瑰红色沉淀物沿毛细血管壁上皮细胞侧分布。图6：PAS染色显示肾小球基质、肾小管基膜等呈玫瑰红色，细胞核呈蓝色。

3 讨 论

肾组织活检是临床检查肾脏疾病的金标准，而肾活检组织免疫病理检查在肾组织病理诊断中起到重要价值[4]。免疫病理检查包括冰冻切片和石蜡切片，但冰冻切片相对于石蜡切片较厚，免疫荧光染色组织细胞结构重叠或不清，因此部分医院采用石蜡切片进行免疫荧光染色[5]。但石蜡切片虽然能避免冰冻切片较厚的劣势，但染色背景高，特异性差，在观察切片同一部位的不同抗原时存在一定局限性[6]。因此有学者采用其他免疫组织染色方式对石蜡切片进行染色，企图提高免疫组化染色的诊断率[7]。

本文对我院慢性肾疾病患者进行肾活检病理诊断，采用免疫荧光染色、六胺银染色法、甲醇刚果红染色法、PAS染色以及Masson染色对我院患者肾活检组织进行病理诊断，结果显示，免疫荧光染色相对于其他几种特殊染色方法，对IgA肾病、膜性肾病以及狼疮性肾病的诊断率均较低。而相对于不同类型肾疾病的肾组织活检时，免疫荧光染色法对狼疮性肾病诊断率高于IgA肾病以及膜性肾病。结果提示，相对于其他染色法，免疫荧光染色对肾活检组织石蜡切片的诊断率明显较低。这可能是由于石蜡切片采用福尔马林进行浸泡，在浸泡固定过程中，Ca2+和其他二价键离子形成紧密复合物封闭抗原，石蜡切片还会出现脱蜡不充分，导致抗原暴露不充分，引起特异性荧光减弱，影响诊断结果。六胺银染色法采用高碘酸氧化组织，使基底膜内枯多糖暴露出醛基，醛基将六胺银还原为黑色金属银，硫代硫酸钠固定显色银盐，去除未反应的银离子，起到诊断作用。甲醇刚果红染色法采用对刚果红选择性亲和力的淀粉样物质进行着色，刚果红与淀粉样物质的羟基以及胺基结合，平行附着在淀粉样物质的纤维上呈红色[8]。PAS染色法采用氧化剂高碘酸，破坏多糖类结构的碳键，使组织中多糖分子的乙二醇基火氨羟基的碳键打开，生成醛类化合物，暴露游离的醛基与雪夫试剂作用，生成新的红至紫红色复合物从而得到定位。Masson染色法利用两种或三种阴离子染料混合完成染色，阴离子染色分子大小和组织的渗透性有关，根据不同组织渗透性不同，选择不同大小阴离子染色可将不同组织显示出来。

[1] 李昌水,张英杰,郑江江,等.蛋白酶K修复石蜡切片免疫荧光染色在肾活检病理诊断中的应用[J].中华病理学杂志,2014,43(1):38～41.

[2] 张翠薇,刘勇,张旭,等.肾活检标本冰冻切片与石蜡切片免疫荧光染色结果的比较[J].泸州医学院学报,2013,36(1):31～34.

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[6] 邢昌赢,沈冬云.肾小球疾病病理诊断及其临床意义[J].中华全科医学,2015,13(9):1388～1389.

[7] 董鸿瑞,王艳艳,王国勤,等.免疫组织化学和免疫荧光染色在肾活检组织石蜡切片磷脂酶A2受体检测中的应用[J].中国医学科学院学报,2015,37(5):562～566.

[8] 王弦,江冬瑞,秦蓉,等.肾穿刺活检标本制片体会[J].临床与实验病理学杂志,2016,32(6):706～707.

Application of Immunofluorescence and other Special Staining in Pathological Diagnosis of Renal Biopsy

LUOJiaoxiu,CHUBing,CAOXiaoshan,etal

(ZhongshanAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,GuangdongZhongshan528403,China)

Objective:To analyze the effect of immunofluorescence and other special staining methods in the pathological diagnosis of renal biopsy. Methods: 58 patients with chronic kidney disease admitted in our hospital from September 2014 to September 2016 were included in the object of study. All patients underwent renal biopsy puncture to obtain tissue using paraffin, respectively by immunofluorescence, six staining of methanol method, Congo red staining and mucin (PAS) and three Masson dye staining, staining results in different ways. Results: The positive rates of IgA, IgM, IgG, C3 and Clq in the patients with different types of nephropathy were significantly higher than those of IgA nephropathy and membranous nephropathy in patients by immunofluorescence staining. In the comparison of different staining methods, it was found that the positive rate of IgA, IgM, IgG, C3 and Clq detected by immunofluorescence staining was significantly lower than that of other staining methods, P<0.05. There was no difference in the diagnostic rate of other staining methods, P>0.05. Conclusion:Comparing with other methods, the rate of pathological diagnosis of renal biopsy is lower than that of other methods. It is recommended to use other special staining methods to diagnose renal tissue.

Immunofluorescence; Six silver amine; Methanol congo red; Mucin; Masson staining solution

1006-6233(2017)06-0898-04

广东省科技计划项目，(编号：2013B031804)

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.06.06

*【通讯作者】储 兵