纯化后中药多糖对鸡新城疫疫苗免疫、T淋巴细胞转化率及IgG、IgM的影响

杨红洋，朱晓庆，谷新利*

（石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003）

纯化后中药多糖对鸡新城疫疫苗免疫、T淋巴细胞转化率及IgG、IgM的影响

杨红洋，朱晓庆1，谷新利1*

（石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003）

为探究中药复方多糖对鸡新城疫抗体含量、T淋巴细胞转化率及IgG、IgM含量的影响，本研究将200羽黄麻肉鸡分成高、中、低剂量组和空白对照组，每组50羽，于7、28日龄进行新城疫疫苗免疫；各试验组鸡于8日龄分别肌肉注射不同剂量纯化中药复方多糖，连续7 d；采集21、42、56、70日龄鸡外周血，ELISA法检测血清中新城疫抗体、IgG和IgM含量，MTT法测定T淋巴细胞转化率。结果显示：与空白对照组相比，各试验组鸡新城疫抗体含量、T淋巴细胞转化率及IgG、IgM的含量均有显著的提高(P<0.05)；中剂量组免疫增强效果显著高于高剂量组和低剂量组 (P<0.05)，高剂量组免疫增强效果高于低剂量组。由此可见，中剂量多糖免疫增强作用优于高剂量和低剂量，为增强免疫作用的最佳浓度。

复方多糖；鸡；新城疫；免疫球蛋白；淋巴细胞转化率

鸡养殖生产过程中，人们通过接种疫苗的方式进行多种鸡传染病的预防，但受多种因素影响，疫苗免疫效果并不理想[1]。而疫苗接种时，配合使用免疫增强剂则可提高疫苗接种成功率。我国传统药物中药，具有药效长、毒副作用小、低残留等多种优点，在畜禽生产中，将其作为提高机体免疫能力的免疫增强剂的研究与应用逐渐增多。

中药多种有效成分对鸡免疫力均有一定影响[2-3]，主要起免疫增强作用的是多糖成分，同时植物多糖还具有抗菌、抗氧化作用[4-5]。目前，对单味中药多糖的研究较多[6]，如五味子多糖[7]、黄芪多糖[8-9]、牛膝多糖[1 0]等。虽然它们均可提高动物免疫力，但相对于中药复方，单味中药的作用效果仍有一定差距。目前，国内对中药复方多糖在提高畜禽集体免疫力方面的研究逐渐增多。

因此，根据石河子大学中兽医实验室前期工作，从中药复方（由当归、党参、熟地、川芎、山楂、何首乌等11味中药组成）中提取，并通过AB-8大孔吸附树脂纯化获得的一定纯度中药多糖，对小鼠具有免疫调节作用[11-13]。本研究利用该中药复方多糖，在鸡进行新城疫疫苗免疫后，注射不同剂量多糖，检测不同日龄鸡新城疫抗体、IgG、IgM含量及T淋巴细胞转化率的动态变化，从体液免疫和细胞免疫两方面探讨中药复方多糖对鸡免疫力的影响，筛选中药复方多糖增强鸡免疫力的最佳浓度，以期为其开发成新的免疫增强剂和在生产中的推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试药物

中药复方（由当归、党参、熟地、川芎、山楂、何首乌等11味中药组成）多糖（含量为77.10%）由本院中兽医学实验室提供。用灭菌蒸馏水配成高剂量(50 mg/mL)、中剂量(25 mg/mL)、低剂量(12.5 mg/mL)3个质量浓度。

1.1.2 药品与试剂

ND活疫苗购自石河子市八师兽医站；鸡新城疫抗体(NDV-Ab)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒购自北京城林生物技术有限公司生产；鸡IgG、IgM ELISA检测试剂盒购自上海蓝基生物有限公司生产；MTT、胎牛血清、鸡外周血淋巴细胞分离液试剂盒购自天津灏洋生物生产。

1.1.3 主要仪器

酶标仪（美国热电，FC）、微量移液器、恒温培养箱。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组及处理

200羽1日龄黄麻肉鸡购自石河子市孵化场，临床检测健康。随机分为4组，每组50羽，于7和28日龄分别进行新城疫疫苗点眼滴鼻免疫。3个试验组于8日龄分别肌肉注射 50、25、12.5 mg/mL中药复方多糖水溶液，连续7 d，空白对照组注射等体积灭菌蒸馏水。

于 21、42、56、70日龄时采集鸡外周静脉血，分离血清，-20℃保存备用。

1.2.2 鸡新城疫抗体含量测定

根据鸡新城疫抗体ELISA试剂盒说明书，利用ELISA检测试剂盒中的标准品建立标准曲线，通过计算得到标准曲线的回归方程，用酶标仪在450 nm波长下检测样品吸光度值(OD值)，在回归方程中计算出各个样品新城疫抗体的含量。

1.2.3 鸡血清IgG、IgM含量的检测

根据鸡IgG、IgM ELISA检测试剂盒说明书，利用ELISA检测试剂盒中的标准品建立标准曲线，通过计算分别得到2种试剂盒的标准曲线的回归方程，通过2种试剂盒检测样品后，再用酶标仪在450 nm波长下检测样品吸光度值(OD值)，分别在相应的回归方程中计算样品IgG、IgM的含量。

1.2.4 鸡T淋巴细胞转化率的检测

采用MTT法检测鸡淋巴细胞转化率[14]。在21、42、56、70日龄，翅静脉采血，按照鸡外周血淋巴细胞分离液试剂盒说明书，分离鸡淋巴细胞，得到的淋巴细胞用悬浮液悬浮，加入96孔板中，设置空白对照孔，37℃，5%CO2培养箱培养48 h。培养结束前3 h加入10 mg/mL MTT 10 μL。培养结束，离心去上清，加入150 μL DMSO溶液，450 nm处检测吸光度。

淋巴细胞转化率公式如下：

淋巴细胞转化率=(试验组平均吸光度-对照平均吸光度)/对照平均吸光度×100%。

根据上式，计算得到淋巴细胞转化率数据，用log2处理后进行分析。

1.2.5 数据处理与分析

采用SPSS19.0统计软件，对实验数据进行分析，用平均数±标准误(Mean±SE)表示结果，采用方差分析和多重比较进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 中药复方多糖对鸡新城疫抗体含量的影响

由表1可知：21日龄时，中剂量组与空白对照组相比差异显著；同时，中剂量组显著高于高剂量组、低剂量组 (P<0.05)；42和56日龄，各多糖组均显著高于空白对照组(P<0.05)，中剂量组显著高于高剂量组和低剂量组(P<0.05)，高剂量组和低剂量组差异不显著；70日龄，中剂量组与其他3组差异显著(P<0.05)。

结果表明，各中药复方多糖组鸡新城疫抗体含量均有提高。

表1 鸡新城疫抗体含量检测结果 pg/mL Tab.1 The results of Newcastle Disease antibody content

2.2 中药复方多糖对鸡血清IgM、IgG含量的影响

由表2可知，21和56日龄，中剂量组显著高于高、低剂量组和空白对照组(P<0.05)，高剂量组、低剂量组与空白对照组之间差异不显著。42和70日龄，多糖组显著高于空白对照组(P<0.05)，中剂量组显著高于高剂量组和低剂量组(P<0.05)，高剂量组和低剂量组之间差异不显著。

结果表明，中药复方多糖能够提高鸡血清中的IgM的含量。

表2 IgM含量检测结果 mg/mLTab.2 The content of IgM

由表3可知，21和42日龄时，中剂量组显著高于高剂量组、低剂量组和空白对照组 (P<0.05)，高剂量组、低剂量组、空白对照组之间差异不显著；56和70日龄，各多糖组IgG含量均显著高于空白对照组(P<0.05)，中剂量组显著高于高剂量组、低剂量组(P<0.05)，高剂量组和低剂量组之间差异不显著。

结果表明，各日龄中药复方多糖组鸡血清IgG含量相对于空白对照组均有提高。

表3 IgG含量检测结果 mg/mLTab.3 The content of IgG

2.3 中药复方多糖对鸡T淋巴细胞转化率的影响

由表4可知，21日龄时，中剂量组的T淋巴细胞转化率显著高于高剂量组、低剂量组和空白对照组 (P<0.05)，高剂量组、低剂量组和空白对照组之间差异不显著。42、56和70日龄，各多糖组均显著高于空白对照组(P<0.05)，且中剂量组极显著高于空白对照组(P<0.01)，中剂量组显著高于高剂量组、低剂量组 (P<0.05)。

表4 T淋巴细胞转化率检测结果Tab.4 T lymphocyte transformation rate

3 讨论

3.1 中药复方多糖对鸡新城疫抗体含量的影响

目前，主要通过接种疫苗的方法对新城疫疾病进行防治，免疫增强剂可大大提高疫苗接种成功率。刘蓉蓉等[15]在雏鸡免疫新城疫免疫后，用饮水方式投喂不同浓度的香菇多糖，发现各试验组新城疫抗体水平显著提高，但本试验结果更优，这可能与给药途径不同有关。本试验以肌肉注射为方式给药，乔海博等[16]通过口服用药，两者所得结果有所差异，这一差异也证明给药途径不同，对中药多糖的效果也有影响。此外，虽然本研究与陈家磊等[17]的用药方式相同，但其为单味车前草多糖，而本研究采用的是中药复方多糖，发现中药复方多糖的作用效果优于单味中药多糖。

本试验中，多糖组鸡血清中新城疫抗体的含量水平均有提高，且以中剂量组的效果最好，其原因可能是多糖的浓度越高，鞣质等其他成分含量也越高，影响了多糖的作用效果，或者是由于多糖能直接调节免疫细胞，高剂量的多糖由于浓度过高，对鸡免疫能力的调节有一定的干扰。

3.2 中药复方多糖对鸡血清IgM、IgG含量的影响

IgG和IgM均是血清中重要的抗体，IgG约占血清总免疫球蛋白的75%，IgM是分子量最大的免疫球蛋白，2种抗体在动物机体的体液免疫中起主要作用。本试验中，中药复方多糖提高了2种免疫球蛋白含量，表明其可提高鸡体液免疫，这与Wang等[18]的研究报道一致。本研究中，鸡21日龄时中剂量中药复方多糖组增强IgG、IgM效果显著，而王佳丽等[19]将中药复方直接烘干饲喂的研究中21日龄时并未表现出明显差异，表明中药复方通过提取纯化得到的一定纯度多糖能更迅速地提高动物机体体液免疫。另外，42、56和70日龄，多糖组增强IgG、IgM效果显著，这与梁英等[20]饲喂黄芩多糖研究结果的趋势一致，但本研究的增强效果更明显，这可能与本研究中的复方多糖经过AB-8大孔吸附树脂吸附解吸后获得纯度更高的多糖以及用药方式不同有关。

3.3 中药复方多糖对鸡T淋巴细胞转化率的影响

T淋巴细胞是机体内一种重要的淋巴细胞，最终分化成多个细胞亚群，转化为致敏淋巴细胞，并产生多种细胞因子，发挥细胞免疫的作用。多糖是一种典型的淋巴细胞激活剂，研究表明多糖能够影响淋巴细胞内钙离子的浓度，而钙离子作为一种重要的信使分子，对淋巴细胞的功能有着重要作用。中药多糖可通过影响淋巴细胞数量及比例增强淋巴细胞免疫活性，促进淋巴细胞增殖、转化等途径发挥免疫调节作用。王思芦等[21]报道鸡枞菌多糖(TAP)能明显升高免疫抑制小鼠T淋巴细胞CD3+和CD4+阳性率，并降低CD8+比率，使各组CD4+/CD8+比值明显升高，同时也使淋巴细胞总数升高，提示TAP在促进T细胞增殖的同时对B细胞及单核细胞也具有增殖作用，从而提高机体免疫功能。本试验的结果显示，中药复方多糖组T淋巴细胞转化率均高于空白对照组，验证了这一结论。在本研究中，42、56和70日龄，各中药复方多糖组均提高了T淋巴细胞转化率，且中剂量中药复方多糖组增强效果高于其他各组，这与商云霞等 的研究结果基本一致。章世元等[23]在苜蓿多糖和黄芪多糖对体外培养鸡外周血淋巴细胞影响的研究表明，3种不同浓度的黄芪多糖对鸡T淋巴细胞转化率均有促进作用，且以中剂量浓度(200 μg/mL)效果最好，与本研究结果基本一致。另外，随着苜蓿多糖浓度不断提高 (最高浓度为50 μg/mL)，其作用效果也逐渐加强，与本研究的结果不一致，这可能与其所用苜蓿多糖的浓度较低有关。

4 小结

本研究提示，中药复方多糖能提高鸡新城疫抗体含量，增加鸡血清IgM、IgG含量，促进鸡T淋巴细胞转化，且中剂量中药复方多糖免疫增强效果最好。中药复方多糖作为来源于植物的天然有效成分，具无毒副作用，低残留，作用效果明显，有效作用持续时间长，容易获得等特点，在未来畜牧业发展中具有广阔的前景。同时，本研究也为将来中药复方多糖的研究提供一定的参考。

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Effects of purified Chinese herbal medicinal polysaccharides on Newcastle Disease vaccine,T lymphocyte transformation rate and IgG,IgM content in chicken

Yang Hongyang1,Zhu Xiaoqing1,Gu Xinli1*
(College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

To explore the effects of traditional Chinese medicine compound polysaccharide on Newcastle Disease (ND)antibody content,T lymphocyte transformation rate and IgG,IgM content.200 HuangMa chickens randomly divided into high does group,middle does group,low does group and control group.Each group was vaccinated with NDV at age of 7 and 28 days old respectively.Each experimental group intramuscular injection of three different purified polysaccharide traditional Chinese medicine at 8-day-old,for 7 consecutive days.Detected 21,42,56,70-day-old chicken serums Newcastle Disease antibody content and IgG,IgM content by ELISA,detected T lymphocyte transformation rate by MTT.The results showed that the experimental groups Newcastle Disease antibody content,T lymphocyte transformation rate and IgG,IgM content was significantly improved,which compared with the control group(P<0.05).The middle dose group was significantly higher than that of high dose group and low dose group(P<0.05),and high dose group higher than the low dose group.It is showed that the best immune enhancing effect is the median concentrations of polysaccharide.

polysaccharide compound;chicken;Newcastle Disease;immunoglobulin;T lymphocyte transformation rate

S858.31；S853.74

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.02.004

1007-7383(2017)02-0152-05

2016-08-23

国家自然科学基金项目(31460673)

杨红洋(1987-)，男，硕士研究生，专业研究方向为临床兽医学,e-mail:hongyangy527@126.com。

*通信作者：谷新利（1963-），男，教授，博士生导师，从事中药制剂开发与应用方面研究，e-mail:xlgu@shzu.edu.cn。