核酸适配体比色法在抗生素残留快速检测中的应用

赵银丽王金荣苏兰利

(河南工业大学 生物工程学院,河南郑州450001)

核酸适配体比色法在抗生素残留快速检测中的应用

赵银丽王金荣苏兰利

(河南工业大学 生物工程学院,河南郑州450001)

传统的抗生素残留快速检测方法主要是以抗体为核心试剂的免疫学方法,免疫学检测方法灵敏度好、操作简单快速。但是,抗体的获得需要多次免疫动物或(和)细胞培养,制备周期一般比较长,实验成本相对也较高。另外,抗体长期储存可能会影响效价。核酸适配体是从随机序列中筛选出来的一段单链寡聚核酸,适配体与靶分子之间的分子识别与抗体极为相似,但适配体比抗体具有更高的特异性,在常温下较稳定,不像抗体那样随着温度的变化容易降解。本文对基于核酸适配体的胶体金比色法在抗生素残留快速检测中的应用做一介绍。

核酸适配体;比色法;快速检测;抗生素

食品质量安全状况可以反映一个国家的经济发展水平和人民生活的质量。而动物源性食品中抗生素的残留，可以通过食物链影响人类的健康。比如细菌的耐药性问题，尤其是人畜共用的抗生素给人类健康带来的威胁。世界各国对动物源性食品中的重要抗生素的残留量都有严格的限量标准。所以，加强对动物源性食品中的抗生素残留的检测是非常必要的。

1 传统的免疫学快速检测方法在抗生素残留检测中的应用

传统的抗生素残留快速检测方法主要是基于抗体的免疫学方法。免疫学方法灵敏度高，耗时也较短，样品的前处理相对简单，可以满足快速筛查的需求。氧氟沙星和恩诺沙星均属于氟喹诺酮类抗生素，Tochi，BN等分别利用抗氧氟沙星的单克隆抗体和抗恩诺沙星的单克隆抗体，建立了分别检测牛奶和肉制品中氧氟沙星和恩诺沙星的酶联免疫吸附分析（ELISA）方法，检测的灵敏度较高，半数抑制浓度分别为1.17ng/ml和0.15ng/ml，可以满足国家对氧氟沙星和恩诺沙星的检测要求。甲砜霉素和氟苯尼考同属氯霉素类抗生素，氟苯尼考又称氟甲砜霉素。An，LL等利用单克隆抗体，建立了同时检测甲砜霉素和氟苯尼考的ELISA 方法，检测的灵敏度高，可以实现动物源性食品中甲砜霉素和氟苯尼考的快速检测。泰乐菌素和替米考星同属大环内酯类抗菌素，Song，YH利用单克隆抗体建立了同时检测泰乐菌素和替米考星的免疫试纸法，检测试纸对泰乐菌素和替米考星的检测限分别为10 ng/ml和20ng/ml。四环素、土霉素、金霉素 同属于四环素类抗生素，Chen，YN利用单克隆抗体建立了同时检测四环素、土霉素、金霉素的免疫层析试纸法，方法的灵敏性可以满足检测的要求。卡那霉素和庆大霉素都属于氨基糖苷类抗生素。He，JX分别利用抗卡那霉素、抗庆大霉素的鸡卵黄抗体（IgY）建立了分别检测卡那霉素和庆大霉素的ELISA方法。卡那霉素ELISA 的半数抑制浓度为4.48ng/ml，庆大霉素ELISA的半数抑制浓度为2.69ng/ml。方法的灵敏性均可以满足检测的需要。

免疫学快速检测法的建立需要制备抗体，抗体的制备需要免疫动物和细胞培养。免疫动物需要多次免疫才能保证较高的效价水平，所以制备周期一般比较长，实验成本相对也较高。另外，抗体长期储存可能会影响效价。核酸适配体与靶分子之间分子识别功能与抗体极为相似，但适配体作用的靶分子范围极广；比抗体具有更高的特异性；亲和力更高，变性复性快速可逆、易功能化修饰与标记等诸多优点。另外，核酸适配体在常温下较稳定，不像抗体那样随着温度的变化容易降解。核酸适配体稳定性好、容易体外合成、成本相对较低等优势为其在检测中的应用提供了可能。

2 核酸适配体比色法的原理

核酸适配体是从随机序列中筛选出来的一段单链寡聚核酸，能特异性地结合蛋白质、有机物小分子、金属离子等各种配体。适配体是通过指数富集配体系统进化（SELEX）技术，从大容量的随机寡核苷酸序列库（1013～1015）中筛选获得。大容量的分子文库几乎涵盖了所有可能的立体构象，理论上可以针对任何靶分子筛选得到其特异性识别的适配体序列。

适配体比色法检测原理是基于纳米金溶液在高浓度 NaCl 的作用下产生凝聚而造成的颜色变化，见图1。金纳米粒子由于其独特的属性在生物传感器中被广泛应用，如良好的生物相容性，容易结合生物分子，表面积大等。基于金纳米粒子聚集为基础的适配体比色法，结果肉眼可见。纳米金一般经由柠檬酸三钠还原氯金酸制备而成，纳米金表面覆盖一层柠檬酸，颗粒之间通过静电排斥作用保持胶体金溶液的稳定性，如果在溶液中加入高浓度的盐，即可破坏胶体溶液的稳定性，纳米金发生凝聚，溶液颜色由红变蓝。而单链 DNA在自由状态下通过碱基和纳米金表面的负电荷发生静电作用而直接吸附到金表面，吸附有单链适配体 DNA的纳米金在高盐浓度下仍可以保持稳定。当溶液中存在靶分子时，适配体与靶标分子特异性结合从而与胶体金解吸附，表面没有吸附 DNA 的纳米金在加入高浓度盐后发生凝聚，溶液由红变蓝。适配体比色法通过灵敏的颜色变化检测有无靶标分子的存在，该方法灵敏特异、肉眼清晰可见，非常适合快速检测。另外，溶液颜色的变化与靶标分子的浓度之间存在一定的相关性，见图2，所以可以利用分光光度计对溶液的吸光值进行测定，也可以半定量靶标分子的浓度。基于核酸适配体的胶体金比色法作为快速检测的手段应用于抗生素残留的检测中，具有非常重要的实用价值。

图1 基于适配体和纳米金的比色法检测原理

图2 靶标浓度与颜色的相关性

3 核酸适配体比色法在抗生素检测中的应用

磺胺二甲氧嘧啶做为抗菌剂，在动物疾病的预防和治疗中被加以应用，但是，药物的不合理使用往往对带来负面的效应。Ailiang Chen 等利用核酸适配体和胶体金，建立了检测磺胺二甲氧嘧啶的适配体比色法。检测灵敏度可以通过优化几个关键参数来实现。比如改变适配体、盐和金纳米粒子的浓度；改变纳米金溶液的pH值。得到较好的检测效果，检测限为50ng/ml，低于残留限量（MRL）（100ng/ml）。适配体比色法是一种非常简单、快速、高灵敏度的分析方法，尤其适用于现场检测。Yeon Seok Kim等利用适配体和胶体金建立了一种检测土霉素的的比色传感器，并且此比色传感器对土霉素有高度的灵敏性和特异性，可以区分强力霉素和四环素。由于靶标与适配体的特异性结合，从而使吸附在胶体金上的核酸适配体被解吸附，进而失去核酸适配体保护的胶体金在高盐浓度下不再稳定，发生凝聚引起颜色的变化。通过对胶体金、核酸适配体、NaCl等参数的优化，得到灵敏性的检测效果。卡那霉素，属于氨基糖苷类抗生素，可以杀死或抑制病原微生物，在饲养动物的感染性疾病种被广泛应用。抗生素的应用应该严格遵守一定的规则，比如剂量、休药期等。如果不合理的滥用，将会产生严重的负面效应，比如引起细菌的耐药性，促进超级细菌的出现。卡那霉素在动物源性食品中的残留通过食物链，可以对人类的健康造成威胁，比如听觉的损伤和对肾脏的毒性。因此，合理使用抗生素、检验食品中是否含有抗生素的残留，是非常重要和有意义的食品安全问题。Kyung-Mi Song等筛选到了结合卡那霉素的核酸适配体，采用还原法制备了胶体金。利用胶体金和核酸适配体建立了检测卡那霉素的比色法。方法的灵敏性高，最低检测限为25 nM，低于国家的最低检测限。胶体金适配体比色法简单易行，肉眼可见，操作简单容易，非常适合快速检测，是较为理想的大规模样本检测和现场检测方法。

4 小结

适配体比色法检测的原理是基于纳米金溶液在高浓度 NaCl的作用下能够凝聚，从而造成溶液的颜色变化。而核酸适配体在合适的高盐浓度下可以稳定金纳米粒子，纳米金溶液仍可以保持红色。当向溶液中加入靶标分子后，由于靶标与适配体的结合又引发金纳米粒子的聚集，产生红色到蓝色的颜色变化。这种颜色变化肉眼可见，并且在多种生物分子的检测中，都表现了高的灵敏度。高灵敏性、实验操作的简单易行性和实验结果的快速可见性，适配体比色法的诸多优点，决定其是一种非常适合基层单位对有害物的检测。作为常规分析方法也是一个很好的选择。

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赵银丽（1973—），女，副教授，博士，主要从事兽药残留检测方法的研究。

名称及编号：河南省科技攻关项目（152102210263）