HPLC法测定烟台柴胡中柴胡皂苷a和d的含量

刘文俊 陈海霞 ��

摘要[目的]建立烟台柴胡中柴胡皂苷a、d含量的HPLC测定方法，研究烟台柴胡中柴胡皂苷a、d的含量，为评价烟台柴胡品质提供科学方法。[方法]采用Thermo ODS-2 HYPERIL（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相为乙腈和水，梯度洗脱；流速1 mL/min；柱温25 ℃；检测波长210 nm。[结果]方法学考察表明柴胡皂苷a、d的峰面积积分值和进样量的线性关系良好，精密度试验的RSD分别为0.67%和0.75%；加样回收率分别为99.4%和98.7%，RSD分别为1.53%和1.76%。不同来源的烟台柴胡中柴胡皂苷a、d的含量相当，总量在0.772%～1.079%。[结论]该方法稳定、重现性好、操作简单，可用于烟台柴胡的质量控制。烟台柴胡中柴胡皂苷a、d含量高于药典规定的柴胡标准，可以作为柴胡的药材新资源。

关键词 烟台柴胡；柴胡皂苷a、d；含量测定；高效液相色谱法

中图分类号S567.7+9文献标识码A文章编号0517-6611（2017）19-0119-02

Content Determination of Saikosaponins a and d in Bupleurum chinese DC.f.vanheuckii （Muell.-Arg.） Shanet Y.Li. by HPLC Method

LIU Wenjun1， CHEN Haixia2*

（1.Chest Hospital of Shandong Province， Jinan，Shandong 250013；2. Qilu Hospital of Shandong University， Jinan，Shandong 250012）

Abstract[Objective] The research aimed to provide scientific basis for evaluating the quality of Bupleurum chinese through establishing HPLC method to determine and study the content of saikosaponins a and d in it.[Method]Thermo ODS2 HYPERIL（250 mm ×4.6 mm，5 μm）column was used. Mobile phase was acetonitrilewater with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min. Column temperature was 25 ℃ and the detection wave length was 210 nm.[Result]Methodology examination indicated that the linear relation between peak area integral value and saikosaponins a and d sample were good. RSD in precision experiment was 0.67% and 0.75%， respectively. Meanwhile， the respective recovery coefficient was 99.4% and 98.7%，RSD was 1.53% and 1.76%，respectively. There was only a little difference in the content of saikosaponins a and d that exist in Bupleurum chinese from different origins. The total content was between 0.772% and 1.079%.[Conclusion]This method was stable， simple and with good reproducibility， which can be used for the quality control of Bupleurum chinese. Saikosaponins a and d content in Bupleurum chinese is found higher than the standard content of which in Bupleurum chinense according to Chinese Pharmacopoeia， so Bupleurum chinese can be used as a new resource of bupleurum.

Key wordsBupleurum chinese DC.f.vanheuckii （Muell.Arg.） Shanet Y.Li.；Saikosaponins a， d；Content determination；HPLC

柴胡為我国常用的传统药材，具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气之功效[1]。因在中医临床使用广泛，野生资源几近枯竭，市场流通多以人工栽培为主，目前我国栽培的柴胡品种主要为北柴胡[2]。烟台柴胡[Bupleurum chinese DC.f.vanheuckii（Muell.-Arg.）Shanet Y.Li.]别名群胡，是北柴胡的变种[3]，主产于山东烟台地区，分布于江苏、吉林、辽宁、山西等地。目前，烟台柴胡已被山东省中药材标准收录[4]，但尚未被《中国药典》收载。在柴胡用量日益增加、野生资源日益减少的情况下，开发柴胡药材新资源、发展柴胡规范化种植是保证柴胡产量及质量的重要手段。

柴胡皂苷是柴胡的主要有效成分，《中国药典》以柴胡皂苷a、d的含量作为检验药用柴胡质量的控制标准[5]。而烟台柴胡在定量分析方面国内鲜见报道。笔者通过建立HPLC测定烟台柴胡中柴胡皂苷a、d的含量方法，以期为烟台柴胡的品质评价提供科学依据，也为烟台柴胡的应用和优良种质的筛选提供试验基础和技术方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器。Waters 600E高效液相色谱仪（杭州瑞析科技有限公司），包括600E四元梯度泵、2996二极管阵列检测器、中文Empower色谱管理系统；LC-350超声中药提取机（济宁市中区鲁超仪器厂）。

1.1.2

试药。柴胡皂苷a对照品（中国食品药品检定研究院，批号110777-201108），柴胡皂苷d对照品（中国食品药品检定研究院，批号110778-200507）；甲醇（色谱纯，美国DNK公司）、乙腈（色谱纯，美国DNK公司）；氨水（分析纯）。

1.1.3

试材。烟台柴胡采自山东烟台及周边地区，采收时间为9月上旬，经山东省中医药专科学校张钦德教授鉴定为柴胡[Bupleurum chinese DC.f.vanheuckii（Muell.-Arg.）Shanet Y.Li.]的根及全草。

1.2方法

1.2.1溶液的制备。

1.2.1.1混合对照品溶液。精密称取对照品柴胡皂苷a、d适量，加甲醇制成浓度分别为0.398和0.526 mg/mL的溶液。

1.2.1.2

供试品溶液。称取烟台柴胡粉末（烟台昆嵛山产地，过四号筛）0.5 g精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液25 mL，密塞，30 ℃水温超声处理（电流0.9 A，频率40 kHz）30 min，滤过，用甲醇20 mL分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，045 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.2.2

色谱条件及系统适应性试验。色谱柱为Thermo ODS-2 HYPERIL（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）：水（B），梯度洗脱（0～25 min，40%～60% A；25～30 min，60% ～40% A）；柱温为室温（25 ℃）；流速1 mL/min；檢测波长210 nm；进样量10 μL。

1.2.3方法学考察。

1.2.3.1标准曲线的绘制。精密吸取“1.2.1.1”的混合对照品溶液，稀释后得柴胡皂苷a对照品溶液浓度为0.398、0159、0.095、0.057、0.034、0.021 mg/mL，柴胡皂苷d对照品溶液浓度为0.526、0.210、0.126、0.076、0.045、0.027 mg/mL的溶液。按照“1.2.2”色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标、进样量（μg）为横坐标绘制标准曲线。

1.2.3.2

精密度试验。取混合对照品溶液10 μL，连续进样5次，测定峰面积，计算RSD值，要求该值小于3%。

1.2.3.3

稳定性试验。取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h测定柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的峰面积并计算RSD值。

1.2.3.4

重复性试验。取同一批号的柴胡样品，按照“1.2.1.2”方法分别制备6份供试品溶液，以“1.2.2”色谱条件测定柴胡皂苷a、d的含量，并计算RSD值，要求该值小于3%。

1.2.3.5

回收率试验。精密称取已知含量的烟台柴胡粉末0.25 g共6份，分别精密加入对照品柴胡皂苷a、d适量，按照“1.2.1.2”方法制备供试品溶液。按照“1.2.2”色谱条件测定柴胡皂苷a、d的含量，计算加样回收率和RSD。

1.2.4

样品的含量测定。选取采自于烟台周边6个不同地区的烟台柴胡样品，按照“1.2.1.2”方法分别制备6批样品的供试品溶液，按“1.2.2”色谱条件测定柴胡皂苷a、d的含量。

2结果与分析

2.1色谱条件及系统适应性试验

在210 nm检测波长及相应色谱条件下，绘制对照品及供试品色谱图（图1）。由图1可见，对照品及供试品溶液中的柴胡皂苷a保留时间均为9 min，柴胡皂苷d保留时间均为16.2 min，样品与其他组分峰的分离度>1.5，理论塔板数按柴胡皂苷d计不低于4 000。

2.2方法学考察

2.2.1

标准曲线的绘制。按照“1.2.3.1”操作，以峰面积积分值Y为纵坐标、进样量X（μg）为横坐标绘制标准曲线（图2），得出柴胡皂苷a、d的线性回归方程分别为：Y=4.63×106X-1 707.8（ra=0.999 9）、Y=4.89×106X-5 731.6（rb=0.999 9），表明柴胡皂苷a进样量在0.21～3.98 μg、柴胡皂苷d进样量在0.27～5.26 μg与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.2.2

精密度试验。按照“1.2.3.2”操作，连续进样5次，测定峰面积，计算柴胡皂苷a、d的RSD分别为0.67%和075%，表明仪器精密度良好。

2.2.3

稳定性试验。按照“1.2.3.3”操作，测定柴胡皂苷a、d的峰面积，计算RSD分别为1.12%、1.23%，说明供试品溶液在10 h内稳定性较好。

2.2.4

重复性试验。按照“1.2.3.4”操作，测得柴胡皂苷a、d的RSD分别为1.56%、1.68%，说明方法的重复性良好。

2.2.5

加样回收率试验。由表1可见，柴胡皂苷a、d的平均回收率分别为99.35%和98.67%，RSD分别为1.53%和176%，表明该方法回收率好，方法可行。

2.3样品的含量测定

方法确定并验证后，选取烟台周边6个不同地区的烟台柴胡样品，进行含量测定，结果如表2。由表2可知，烟台莱阳和烟台牟平柴胡皂苷a的含量比较高，青岛崂山柴胡皂苷a的含量相对低；烟台莱阳和烟台牟平柴胡皂苷d的含量比较高，烟台牙山柴胡皂苷d的含量相对3讨论与小结

采用HPLC法测定柴胡皂苷已有多种方法报道，流动相可以选用甲醇和水[6-7]或乙腈和水[8-12]，但甲醇在检测波长210 nm时，容易产生末端吸收干扰测定，该试验方法选用乙腈与水，具有更好的检测结果。目前报道的检测方法一般参照《中国药典》方法进行梯度洗脱，但柴胡皂苷a、d出峰时间较晚，分别于20和25 min左右出峰，笔者经过多次试验确定洗脱条件，使出峰时间均提前至9和16 min左右，分离效果良好，缩短了测定时间。

该试验结果显示，不同来源的烟台柴胡中柴胡皂苷a的含量为0.432%～0.545%，柴胡皂苷d的含量为0.326%～0.534%，表明烟台周边地区烟台柴胡的质量比较稳定；柴胡皂苷a、d的总含量为0.772%～1.079%，超过2010版《中国药典》中柴胡项下柴胡皂苷a、d总含量（0.3%）的规定，表明就皂苷类成分而言，烟台柴胡可以作为柴胡的药材新资源。

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