不同灭菌方法对茜草组织培养污染率控制的研究

陈建+常权记

摘要：利用不同灭菌方法对茜草外植体进行处理，观测组织培养污染率、愈伤组织诱导率。实验表明：10%高锰酸钾溶液浸泡3分钟效果最佳，污染率30%，愈伤组织诱导率25%；75%酒精溶液灭菌10s处理效果较差，污染率60%，愈伤组织诱导率为10%。

关键词：茜草；灭菌；组织培养；污染率；诱导率

中图分类号：R282 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.14.019

茜草（Rubiasylvatica），又名锯锯藤、红茜草、挂拉豆、小血藤、过山龙等， 茜草科茜草属，为多年生攀援草本植物。其味苦， 归肝心经， 有凉血止血作用，可用于治疗吐血、外伤出血，经脉阻塞、关节麻木、跌扑肿痛等，其成分具有消炎、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、抗辐射、镇咳祛痰等功效，在医药上具有很高的应用价值[1]。

自然界茜草生长缓慢，野生茜草根茎自然产量低，茜草的药用价值主要是在根茎，由于人们的大量采挖，导致野生资源趋于枯竭。野生种驯化移栽成活率低。为了保护国内茜草品种以及产量资源，对野生品种进行驯化，满足茜草生产规模化栽培的需要，弥补国内茜草资源不足，开展茜草快速繁殖及组织培养的研究就显得更为迫切和重要。本试验是探究不同灭菌方法对组织培养污染率控制，经过不同灭菌方法的处理，旨在探索出最适组织培养的灭菌方法，使其达到快速繁殖甚至工厂化提供参考。

1材料与方法

1.1材料

茜草原材料采自陕西省安康市汉滨区长岭村火车道旁。外植体采用当年生生长健壮、污染较少的幼嫩枝条为实验材料，直径为0.1～0.2厘米。

1.2培养基及培养条件

本实验使用MS+2.4-D2.0毫克/升/l+KT0.1mg/l[2]。培养基pH调至6.0。在26℃温度条件下，光照1000lx，环境相对湿度70%～80%。茎段接种平放和斜插入培养基，叶片接种时叶片正面朝上，平放在培养基上[3]。

1.3实验处理

消毒剂选择：

A1：0.1%次氯酸钠15min+75%酒精10S+0.1%氯化汞8S

A2：10%高锰酸钾溶液3min+75%酒精10S+0.1%氯化汞8S

A3：0.1%过氧化氢溶液10min+75%酒精10S+0.1%氯化汞8S

A4：75%酒精10S+0.1%氯化汞8S

在消毒剂选择中，A1：次氯酸钠消毒后，用无菌水清洗3次，75%酒精消毒后，无菌水清洗3次，0.1%氯化汞灭菌后用无菌水清洗5次。A2：高锰酸钾消毒后，用无菌水清洗3次，用保鲜膜包裹，静置8小时[4]，75%酒精消毒后，无菌水清洗3次，0.1%氯化汞灭菌后用无菌水清洗5次。A3：过氧化氢消毒后，用无菌水清洗3次，用保鲜膜包裹，75%酒精消毒后，无菌水清洗3次，0.1%氯化汞灭菌后用无菌水清洗5次。A4：75%酒精消毒后，无菌水清洗3次，0.1%氯化汞灭菌后用无菌水清洗5次。全部外植体边使用边切，保证外植体的生理活性。

2 实验结果及分析

不同灭菌方法对污染率及愈伤组织诱导的影响（污染率=污染外植体/接种外植体数×100%，愈伤组织诱导率=发生愈伤组织数/接种外植体数×100%）。

由表1得出：使用不同灭菌方法的处理后，效果最好的是10%的高锰酸钾溶液，污染率30%，愈伤组织诱导率也较高，为25%；效果最差为只使用75%酒精+0.1%氯化汞的方法，污染率为60%，愈伤组织诱导率10%。10%的高锰酸钾氧化性比较小，对外植体的损害较小，虽然消毒灭菌时间比较长，但是效果比较明显，能够显著诱导愈伤组织形成；过氧化氢处理后，因为消毒灭菌后，产生较多氧离子，对茜草损害比较大，导致不能产生较多的愈伤组织。使用氯化汞消毒灭菌时，由于其毒性大，对外植体损害大，因此使用氯化汞只灭菌8S。

3 分析讨论

有学者经过多种灭菌方法对外植体进行灭菌，得到最佳灭菌方法，即75%酒精灭菌30S，后用10%次氯酸钠灭菌20分钟处理。植物组织培养过程中，污染是影响外植体诱导形成愈伤组织的主要因素。植物组织培养中用的外植体大多从野外直接获取，因此通常都携带了自然界中的菌种，因此造成外植体诱导愈伤组织污染率较大。

本实验使用了10%高锰酸钾溶液灭菌三分钟，清洗后用75%酒精灭菌10S，清洗3次后使用0.1%氯化汞8S，清洗5次，进行接种，最终得到了较适合的灭菌方法，取得了较好效果，为以后茜草组织培养研究提供理论上的参考。

本次试验中，加入7.0克/升琼脂[5]，采用高压蒸汽灭菌，设置灭菌温度为121℃，灭菌时长25分钟，培养基在灭菌前测得pH为6.0，培养基凝固。灭菌后培养基未凝固，颜色偏黄。具体原因有待进一步验证。

参考文献

[1]张丽萍，杨春清，王瑞芳，等.181种药用植物繁殖技术[M].北京：中国农业出版社，2004：348.

[2]何俊平，■小云.不同培养基配方对铁皮石斛生根培养的影响[J].江苏农业科学，2013，41（02）：57-59

[3]曾庆玲，尹书亮，魏静.外植体不同长度及接种方式对马尾松愈伤组织诱导的影响[J].林业科学，2014，62（02）：175-

183.

[4]王隽.马铃薯的高锰酸钾消毒[J].福建农业科技，1990，4（32）：38.

[5]鞠倩.生长调节剂及蔗糖浓度对彩叶草组织培养物迷迭香酸含量的影响[D].山东：山东农业大学，2007.

作者简介：陈建，在读本科生，研究方向：农学；常权记，本科学历，副教授，研究方向：设施栽培。