过度煎炸油脂对大鼠糖脂代谢及相关基因表达的影响

周中凯 王雨扬 刁永佳 王 芳

(天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

过度煎炸油脂对大鼠糖脂代谢及相关基因表达的影响

周中凯 王雨扬 刁永佳 王 芳

(天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

取24只生长状况相同的Wistar雄鼠随机分成3组，每天分别灌胃1.5 mL正常油脂、过度煎炸油脂，对照组灌胃等量的生理盐水。4周后眼眶取血，6周后腹部主动脉取血，用于各项生化指标的检测；取肝脏组织进行基因表达状况的检测。结果显示：干预4周后，与对照组相比，正常油脂组血脂含量均有所升高，过度煎炸油脂组基本与对照组持平；干预6周后，正常油脂组甘油三酯高于对照组，而过度煎炸油脂组甘油三脂、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇水平均明显低于对照组(P<0.01)。血糖水平在对照组、正常油脂组、过度煎炸油脂组呈逐渐增高趋势。qPCR结果表明：短期食用过度煎炸油脂即会导致大鼠肝脏组织ACC、ACOX1基因显著下调(P<0.05或P<0.01)，这说明过度煎炸油脂中的毒性物质能通过影响脂肪酸正常的合成和代谢，造成机体脂肪酸合成代谢紊乱。同时Insig1基因明显下调(P<0.01)，说明过度煎炸油脂会对机体糖代谢产生一定影响。

过度煎炸油 糖脂代谢 基因表达 qPCR

据统计，在一些经济发达地区，接近一半的午餐和晚餐食品是煎炸食品，油炸食品由于其酥脆可口的特性而备受喜爱[1]。但是，油脂在煎炸过程中会发生复杂的品质变化，主要通过一些氧化和分解反应(包括聚合、水解、异构化和环化等)产生很多极性物质，这些物质对机体有很强的毒害作用，并且随着煎炸时间的延长会逐渐积累，摄入人体后会导致基因突变、染色体突变从而诱发癌症如乳腺癌、结肠癌等[2]。随着食品安全意识的普及,这逐渐成为消费者极其关心的食品安全问题,同时也是国内外相关领域竞相研究的热点，因为煎炸油的健康与人类的健康密切相关[3]。

目前，国内外对于油脂多次煎炸过程中的主要成分变化已经有了非常深入的研究。李东锐等[4]以高级大豆烹调油和棕榈油混合物为煎炸油，对其品质进行研究，发现随煎炸时间延长，煎炸油中的聚合物含量大大升高，黏度增大，不饱和脂肪酸含量下降，碘值、皂化值降低，酸值、过氧化值升高。Aladedunye等[5]研究煎炸过程中油脂的降解及营养品质变化，结果表明，极性值、酸值、色泽和反式脂肪酸随油炸温度和时间的增加呈显著性变化。近年来，国内外对于油脂加热过程中的成分变化已经研究得相当深入，但是对于过度煎炸油脂摄入机体后如何影响自身代谢的研究却很少。本试验采用健康成年大鼠，通过每天摄入一定量的煎炸油脂，来研究其对机体糖脂代谢的影响，以及对于体内一些糖脂基因信号通路的作用，这对于我们更加深入地了解煎炸油对机体的毒害作用，指导人们绿色健康饮食都具有十分深远的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物

健康雄性SPF级成年Wistar成年大鼠32只：购自人民解放军军事科学医学院实验动物中心，生产许可证编号：SCXK-(军)2012-0004，体重290～310 g，于天津科技大学SPF级动物实验研究中心饲养。饲养条件：温度20～25 ℃，湿度50%～55%，正常采光；自由摄食进水，饲喂基础饲料。动物实验符合国家《实验动物管理条例》，并经过天津科技大学动物饲养管理中心认可。

1.1.2 仪器与试剂

MK-3酶标仪：美国Thermo公司；Neofuge 13R台式高速冷冻离心机：Heal Force Development Ltd公司；Mx-3000pTM实时荧光定量PCR仪：吉泰生物科技有限公司；UV-2102PCS型紫外可见分光光度计：尤尼柯(上海)仪器有限公司；Thermo 991超低温冰箱：美国Thermo公司。

优质食品级大豆油：市售；血清甘油三脂(TG)、总胆固醇(TCH)试剂盒：浙江东瓯诊断产品有限公司；高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)试剂盒：南京建成生物制剂有限公司；罗氏血糖仪活力型：Sanmina-SCI公司；RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒、One Step SYBR RT-PCR kit：宝生物生物工程(大连)有限公司；PCR引物：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组及处理

将24只Wistar大鼠随机分为3组，每组8只，分别为：对照组、正常油脂组、过度煎炸油脂组。实验动物在适应性喂养1周后，各组动物分别灌胃等量的生理盐水、正常油脂(未经任何处理的食品级大豆油)、过度煎炸油脂开始干预，1.5 mL/d，与此同时，自由进食基础饲料，共干预6周。

为模拟多次煎炸过程中油脂主要成分的变化，并且研究一些淀粉、蛋白类食物煎炸后产生的毒性物质对机体的影响，参照Kuligowski等[6]制备煎炸油脂的方法并进行改进，具体做法为：将原样大豆油加热后(控制在190 ℃左右)，间歇性煎炸薯条、鸡排、鱼丸、鸡翅、薯片、馒头片等，每天煎炸5～6 h，如此重复约1周，制备过度煎炸油脂。

1.2.2 饮食条件

试验过程中对动物提供充足的基础饲料，正常进食进水。饲料成分表见表1。

表1 动物饲料成分表

1.2.3 各指标的测试方法

血清血脂相关指标的检测：干预4周时对动物麻醉、固定，眼眶取血1.5 mL；干预6周后，禁食不禁水12 h后，腹部主动脉取血，同时取肝脏组织，断颈处死。全血静置2～3 h后，在高速冷冻离心机中3 500 r/min离心15 min，用移液器吸取上层血清分装到eppendorf管中，于-80 ℃超低温冰箱中保存。采用试剂盒法测定动物血清中血脂指标的含量，每组8个样品，3组共计24个样品。指标测试严格按照试剂盒说明书要求，每个样品重测3次。血糖指标测定严格按照罗氏血糖仪操作要求进行，测定大鼠非空腹状态下血糖水平，每个样本测3次取平均值。

血糖水平的检测：固定大鼠，对其尾尖消毒后，用取血针取1滴血，点在血糖试纸上，迅速在血糖仪记下示数，每只大鼠每次测3次取平均值。

基因的mRNA表达量：采用总RNA提取试剂盒提取大鼠肝脏组织总RNA，严格按照试剂盒说明书操作，之后将1 μg RNA反转录为cDNA用于后续的实时荧光定量PCR的测定。以18S基因为内参基因，每次从3个试验组中个取1个样本进行试验，每个指标重复测定3次，相当于1个基因检测9只大鼠。qPCR条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，退火温度60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环后72 ℃ 10 min，试验分别记录每个样品的Ct值，试验采用2-ΔΔCt法处理数据，计算各基因相对表达量：

R=2(Ct Calibrator (GOI)-Ct Unknown (GOI))/2

[Ct Calibrator (RefGene)-Ct Unknown (RefGene)]

式中：Unknown为试验组；Calibrator为对照组；GOI 为目的基因；RefGene为内参基因。表达变化情况通过试验组与对照组的比值(倍数)表示出来。选取的内参基因(18S)及目的基因的引物序列见表2。

表2 用于实时定量PCR的引物序列表

1.3 统计学分析

2 结果与讨论

2.1 油脂干预对大鼠血清中血脂水平的影响

如表3所示，连续干预4周后3组大鼠血清中的血脂水平均发生了变化。其中TG、TCH含量过度煎炸油脂组水平基本和对照组相等，而正常油脂组动物血清中的含量略有升高；HDL-C含量在对照组、正常油脂组、过度煎炸油脂组之间呈微弱增长趋势，过度煎炸油脂组反而显著升高(P<0.05)。这说明在短时间干预后正常油脂和过度煎炸油脂均不会大幅改变大鼠血清血脂水平，过度煎炸油毒性还未引起受试动物生命体征的明显波动。而在连续干预6周之后，正常油脂组血脂含量基本和对照组持平，只有TG和HDL-C含量稍有下降；而过度煎炸油脂组的血脂成分则发生了显著变化，其中TG、TCH和HDL-C较其他2组极其显著性下降(P<0.01)。同时，正常油脂组HDL-C的差异也具有统计学意义(P<0.05)，可见长期过量摄入正常油脂也会在一定程度上影响机体健康。

2.2 油脂干预对大鼠血糖水平的影响

图1 干预4/6周后大鼠血糖的变化

分别在第4周和第6周测定大鼠血清中血糖含量(非空腹)，血糖水平如图1所示。结果表明，正常油脂和过度煎炸油脂均会使大鼠血糖略微升高，但是只有过度煎炸油脂组与对照组相比差异显著(P<0.05)。此外，从变化趋势来看，过度煎炸油脂的对增加血糖幅度最大，尤其在长时间食用过度煎炸油脂后对机体血糖水平会有较大的影响，但正常油脂的摄入对机体血糖水平的影响也不容忽视。

2.3 qPCR检测各组大鼠肝组织中相关mRNA的表达量

乙酰辅酶A羧化酶基因(ACC)和乙酰辅酶A氧化酶(ACOX1)均出现了在正常油脂组上调，在煎炸油脂组下调的现象，而胆固醇调节原件结合蛋白(SREBP1)在2组油脂试验组均出现了明显下调(P<0.01)，且下调量基本相等。由于机体在形成细胞膜脂肪层以及以脂肪的形式储存能量时需要合成脂肪酸，而乙酰辅酶A羧化酶是脂肪酸合成代谢中的限制性酶，在哺乳动物脂肪酸合成代谢中起着十分重要的作用。由图2可见正常油脂能促进ACC基因表达，加速脂肪酸合成代谢，而煎炸油脂导致ACC基因表达的显著性下调(P<0.05)，这可能是由于煎炸油中一些毒性化合物严重干预ACC基因的表达，从而造成脂肪酸合成代谢受阻。另外，ACOX1基因在脂肪酸β氧化代谢脂中发挥着关键性的作用，在过度煎炸油脂组出现了明显下调，这进一步说明该试验组正常的脂肪酸代谢受到破坏，而正常油脂对肝脏脂肪酸代谢影响不大。脂肪酸合成酶基因(FAS)在2组油脂试验组均未出现明显变化，说明该脂肪酸合成途径未受到显著性影响。Kadota等[7]研究表明正常血脂谱的遗传变异与相关血脂基因在DNA水平上差异表达有关，这些差异可通过影响血脂脂肪酸和胆固醇的合成和代谢而影响血脂的水平，而SREBP1基因作为一种膜结合转录因子，可以增强胆固醇、脂肪酸、三羧酸甘油酯生物合成酶基因的转录，本研究发现在膳食中适当提高脂肪的摄入会显著降低SREBP1基因的表达，相关机理需做进一步的研究。

图2 mRNA的相对表达量

表3 不同试验条件持续干预4/6周后大鼠血脂相关指标的变化/mmol/L

注：*表示与对照组对比具有显著差异(P<0.05)，**表示与对照组对比差异极显著(P<0.01)。

Insig1、Insig2基因是胰岛素诱导基因，在葡萄糖代谢平衡中具有重要作用，同时也能调节细胞胆固醇和脂类代谢[8]，从图2结果可以看出试验组均受到较大影响，尤其是对于Insig1基因影响，煎炸油脂的干预显著性地降低其表达水平(P<0.01)，这说明煎炸油脂在较大程度上会影响机体胰岛素的分泌和糖代谢水平。

3 结论

在较短的时期内食用过度煎炸油即会导致大鼠肝脏组织ACC、ACOX1基因显著性下调，这可能是由于其中的毒性物质会对机体造成明显损伤，从而影响脂肪酸正常的合成和代谢，继而影响机体的正常生命活动。同时食用过度煎炸油脂也会导致胰岛素诱导基因1(Insig1)明显下调，影响机体糖代谢。结果还显示，适当地提高油脂的摄入量便会导致SREBP1、Insig1基因下调，这均会对机体的糖脂代谢造成不同的影响。

[1]Isengard H D, Schmid M. Methods for surveying the quality of frying fats and oils[J]. Food Australia, 2001, 53(3):96-100 [2]Jaswir I, Man Y B C, Kitts D D. Effect of natural antioxidants in controlling alkaline contaminant materials (ACM) in heated palm olein[J]. Food Research International, 2000, 33(2): 75-81[3]于新华，孙红文，徐文柏，等. 关于开发应用食品专用煎炸油的讨论[J]. 粮食流通技术，2009(2)：37-40 Yu X H, Sun H W, Xu W B, et al. Discussion about development and application of food special frying oils[J]. Grain Distribution Technology, 2009(2): 37-40

[4]李东锐，毕艳兰，肖新生，等. 食用油煎炸过程中的品质变化研究[J]. 中国油脂，2006(6)：34-36 Li D R, Bi Y L, Xiao X S, et al. Research on the change of edible oil quality during frying process[J]. China Oils and Fats, 2006(6): 34-36

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[6]Kuligowski J, Carrión D, Quintás G, et al. Sample classification for improved performance of PLS models applied to the quality control of deep-frying oils of different botanic origins analyzed using ATR-FTIR spectroscopy[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2011, 399(3): 1305-1314

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Effect of Deep-Frying Edible Oil on Glucose and Lipid Metabolism and Its Related Gene Expression in Rats

Zhou Zhongkai Wang Yuyang Diao Yongjia Wang Fang
(College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457)

24 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups, in which each rate was

with an equal amount of 1.5 mL of saline，normal oils, and deep-frying oils, respectively. Each rate in the control group was received with equal normal saline. Their bloods were taken from the eyes and abdominal after 4 weeks and 6 weeks, respectively for detection of various biochemical indexes. Liver tissues were used for relative gene expression detecting. The results showed that the normal serum lipid content increased in each group compared with that of control group, its content in deep-frying oils group was very close to the control group after 4 weeks intervention. While the triglyceride (TG) content in the normal oil group was higher than that in the control group, TG, total cholesterol, and high-density lipoprotein levels in deep-frying oil group were significantly lower than that of the control group

after 6 weeks’ intervention (P<0.01). There was an increasing tendency in the blood glucose level of the control group, normal oils group and deep-frying oils group. The results of quantitative real-time PCR showed that after the long-term consumption of deep-frying oils, the ability to regulate the ACC and ACOX1 genes in liver tissues was declined (P<0.05 orP<0.01), which indicated that toxic substances in deep-frying oils could result in synthesis and metabolism disorder of fatty acid by influencing normal synthesis and metabolism of fatty acid. At the same time, the Insig1 gene was decreased significantly (P<0.01), which indicated that deep-frying oils would have a certain effect on the body’s glucose metabolism.

deep-frying oils, glucose and lipid metabolism, gene expression, quantitative real-time PCR

国家自然科学基金(31471701)

2015-08-01

周中凯，男，1964年出生，教授，粮油科学与营养

TS221

A

1003-0174(2017)04-0070-05