薄层色谱画像解析法快速判定鱼肉的脂质氧化度

于 慧，佐藤实，山口敏康，中野俊树

（1.鲁东大学食品工程学院，山东 烟台 264025；2.日本东北大学农学研究科，日本 仙台 981-8555）

薄层色谱画像解析法快速判定鱼肉的脂质氧化度

于 慧1，佐藤实2，山口敏康2，中野俊树2

（1.鲁东大学食品工程学院，山东 烟台 264025；2.日本东北大学农学研究科，日本 仙台 981-8555）

为了快速判定鱼肉的脂质氧化度，建立薄层色谱画像（thin layer chromatography image，TLC-i）解析法快速测定鱼类氧化生成的极性化合物含量。取黄鳍金枪鱼油0.5 μL点样于硅胶板上，用正己烷-乙醚-醋酸（30∶70∶1，V/V）的混合液展开12 min后，3%醋酸铜磷酸溶液喷雾显色，150 ℃加热15 min后，将氧化生成的极性化合物通过面积分析软件进行半定量分析。结果表明，此方法测得的极性化合物含量与常用的过氧化值（peroxide value，POV）、羰基值（carbonyl value，CV）相比，具有较好的相关性，相关系数分别为0.993 8和0.972 5。将此方法用于判定远东多线咸鱼在4 ℃贮藏期间的脂质氧化情况，发现极性化合物含量与POV具有较好的正相关性（R2=0.962 5）。将此方法用于判定盐渍红鲑在-5 ℃贮藏期间的脂质氧化情况，发现极性化合物含量与a*值具有较好的负相关性（R2=-0.822 9）。结果表明，该方法具有简单化、快速化、微量化、可视化的优点，且不需要昂贵的设备，适合鱼肉脂质氧化度的快速评价。

薄层色谱画像解析；脂质氧化；极性化合物；快速检测

鱼类由于含有丰富的多不饱和脂肪酸，如二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（decosahexaenoic acid，DHA）等，在贮藏过程中极易氧化生成氢过氧化物，过氧化物逐渐进一步分解生成醛、酮类物质，这不仅使鱼类的风味和营养价值有所降低，还对人体健康产生很大危害，如促进衰老，导致心脑血管疾病和肿瘤等[1-4]。目前常用的脂质氧化测定法有过氧化值（peroxide value，POV）、羰基值（carbonyl value，CV）、硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）、气相色谱、液相色谱等[5-7]。POV是评价脂质初级氧化产物氢过氧化物的主要指标，也是油脂过氧化值国际通过分析方法。但此方法需要花费大量的时间、玻璃仪器、溶剂和油脂，检测成本高，检测灵敏度较低，且过氧化物不稳定，随时会分解，只能粗略地反映脂质氧化程度[8]。CV是评价脂质次级氧化产物羰基化合物量的指标，也是评价脂质氧化度的另一重要指标[9]。但此方法和POV一样，操作繁琐，需要花费大量的时间。气相色谱和液相色谱等多种色谱技术已用于测定脂质的氧化程度，但是气相色谱分析前需要对样品进行衍生化，此步操作可能会引起稳定性较差的不饱和样品物性变化，从而带来检测误差[2]，且这些方法只适合实验室检测，难以满足生产中现场化测定的要求。为了开发简便、快速的鱼肉脂质氧化度的判定方法，本实验以黄鳍金枪鱼油为例建立了薄层色谱画像（thin layer chromatography image，TLC-i）解析法。鱼类在氧化酸败过程中产生的脂质过氧化物及其分解产物、游离脂肪酸等[10-11]，会使其极性显著增加，因此，脂质氧化也可以通过极性化合物含量的检测来表征。总脂质经薄层色谱分离后，将氧化生成的比甘油三酯极性强的化合物利用面积分析软件进行半定量，并利用该法评价远东多线咸鱼和盐渍红鲑在低温贮藏过程中的脂质氧化度，以期为今后进一步评价鱼类的脂质氧化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄鳍金枪鱼油（Thunnus albacares） 日本Maruha Nichiro食品株式会社；远东多线咸鱼（Pleurogrammus azonus）（PE保鲜膜包装，4 ℃贮存）和冷冻盐渍红鲑（Oncorhynchus nerka）（真空包装，-18 ℃贮存）日本宫城县仙台市超市。

2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，2,4-DNPH）、反-2-癸烯醛 美国Sigma公司；正丁醇、氯仿、冰醋酸、碘化钾、乙醚、氢氧化钾等均为分析纯。1.2 仪器与设备

UV-2550型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；NF777型手持式色差计 日本电色工业株式会社；Silica gel 60 F254硅胶板 德国Meker公司。

1.3 方法

1.3.1 黄鳍金枪鱼油的加速氧化

将鱼油分装在小玻璃皿（内径28 mm，深度13 mm）中，每个玻璃皿放3 mL，将其放入50 ℃的恒温箱中保存，每天定时取样测定。

1.3.2 远东多线咸鱼总脂质的提取

将远东多线咸鱼置于4 ℃贮存，定时取其鱼肉样品5 g，按照Folch等[12]方法对其总脂质进行提取。

1.3.3 盐渍红鲑总脂质的提取

将红鲑切成7～8 cm长的鱼段，随机装入保鲜袋中，分成2 组，一组充入氧气，一组不做任何处理（以下分别称为氧气组和对照组），置于-5 ℃贮存。每周取其鱼肉样品5 g，按照Folch等[12]方法对其总脂质进行提取。

1.3.4 TLC-i解析法测定

用微量注射器取0.5 μL鱼油，点样于活化硅胶板上，用正己烷-乙醚-醋酸（30∶70∶1，V/V）的混合液展开12 min，后采用3%醋酸铜磷酸溶液喷雾显色，150 ℃加热15 min后，将氧化生成的极性化合物通过面积分析软件进行半定量分析。

1.3.5 POV的测定

参照Bilinski等[13]的方法，称取50 mg鱼肉脂质于20 mL玻璃瓶中，加入3 mL氯仿-醋酸（2∶3，V/V）混合液溶解，在通入氮气条件下，加入0.5 mL饱和KI溶液，搅拌1 min，后置于暗处5 min。取出后加3 mL蒸馏水，摇匀后加入淀粉指示剂1～2 滴，用0.01 mol/L Na2S2O3标准溶液滴定至蓝色褪去，记录所需Na2S2O3标准溶液体积。同时作空白对照实验。按公式（1）计算样品POV：

式中：A为样品滴定时所消耗的Na2S2O3标准溶液体积/mL；B为空白实验滴定时所消耗的Na2S2O3标准溶液体积/mL；F为Na2S2O3标准溶液的滴定度；S为样品质量/g。1.3.6 CV的测定

参照Endo等[14]的方法，定时称取黄鳍金枪鱼油10 mg用1 mL正丁醇溶解。取0.5 mL加入0.5 mL 0.05%的2,4-DNPH溶液，40 ℃水浴加热20 min。冷却至室温后加入4 mL 8% KOH溶液混匀，2 000 r/min离心5 min。取上清液于波长420 nm处测定吸光度。另取0.5 mL反-2-癸烯醛标准溶液按照上述步骤操作，CV表示为μmol羰基化合物量/g鱼油。

1.3.7 色差值的测定

定时取红鲑鱼肉6 g向其加入氯仿-甲醇（2∶1，V/V）的混合溶液27.5 mL，匀浆过滤。取其残渣再加入氯仿-甲醇（2∶1，V/V）的混合溶液16.5 mL，匀浆过滤后合并滤液。向其加入0.9% NaCl溶液，振荡混匀，离心10 min得两相液面。取下层氯仿溶液3 mL置于玻璃皿中，用手持式色差计测定红度值（a*）的变化。

1.4 数据处理

采用Tukey-Kramer post-hoc test对实验结果进行差异显著性分析，用Excel 2010软件对数据进行平均数和标准偏差的统计分析并作图。

2 结果与分析

2.1 黄鳍金枪鱼油极性化合物含量的测定

图1 黄鳍金枪鱼油贮藏过程中极性化合物含量的变化Fig. 1 Time course of the amount of polar compounds in yellowfin tuna oil during storage

从图1A中第0天的展开图谱可以看出，黄鳍金枪鱼油中的甘油三酯含量较高，而磷脂含量较低。在50 ℃伴随贮藏时间的延长，图中Ⅰ部分的颜色逐渐加深，说明比甘油三酯极性强的化合物在逐渐形成，这些极性化合物是鱼油氧化酸败生成的比甘油三酯极性较强化合物的统称，主要包括过氧化物、分解生成物、聚合物及游离脂肪酸等[10-11]。利用面积分析软件将极性化合物Ⅰ占全脂质（Ⅰ＋Ⅱ）的比例作为极性化合物含量的表示方法。如图1B所示，极性化合物含量随贮藏时间的延长逐渐增加，和图1A中观察到的Ⅰ部分颜色的变化趋势基本一致。该方法平行处理5 份，相对标准偏差在0.15%～1.49%之间，可见该方法重复性和稳定性较好。2.2 黄鳍金枪鱼油的POV变化

POV是评判油脂氧化酸败程度的重要指标，一般POV越高其氧化酸败程度也越严重[7]。如图2A所示，随着贮藏时间的延长，曲线呈一定的上升趋势，说明黄鳍金枪鱼油发生了不同程度的氧化酸败。同时发现该曲线的上升趋势与图1B中极性化合物曲线的上升趋势较为接近，比较极性化合物含量与POV的相关性，发现它们具有较好的正相关性（R=0.993 8）（图2B）。

图2 极性化合物含量与POV的相关性Fig. 2 Correlation between the amount of polar compounds and POV

2.3 黄鳍金枪鱼油的CV变化

图3 极性化合物含量与CV的相关性Fig. 3 Correlation between the amount of polar compoundsand CV

鱼油在贮藏过程中受环境影响，首先氧化生成氢过氧化物，随后分解成含羰基的化合物，这些二次产物中羰基化合物（醛、酮类化合物）的积聚量就是CV[9]。一般CV越高，其氧化生成的醛、酮等物质的量越高。如图3A所示，随着贮藏时间的延长，曲线呈一定的上升趋势，说明黄鳍金枪鱼油发生了不同程度的氧化酸败。该曲线的上升趋势也与图1B中极性化合物曲线的上升趋势较为接近，比较极性化合物含量与CV的相关性，发现它们也具有较好的正相关性（R=0.972 5）（图3B）。结合极性化合物含量与POV也具有较好的正相关性，说明该方法有较好的精密度。以上结果说明利用TLC-i解析法测定该鱼油的脂质氧化度是可行的。

2.4 远东多线鱼极性化合物含量的测定

图4 远东多线咸鱼贮藏过程中极性化合物含量的变化Fig. 4 Temporal changes in the amount of polar compounds in salted Pleurogrammus azonus during storage

咸鱼由于风味独特、易于贮存，且鱼肉中含有丰富的多不饱和脂肪酸，一直深受消费者的喜爱[15]。远东多线鱼主要分布于日本北海道周围水域[16]，其含油量约为10%，多以腌制品形式销售。但其盐干品在加工及贮存过程中，脂肪容易氧化变质，导致产品发黄出油，造成不愉快的嗅感和味感[17-18]。远东多线咸鱼在4 ℃贮藏过程中极性化合物含量的变化如图4A所示。第0天的展开图谱可以看出，远东多线咸鱼的脂质主要以甘油三酯和固醇的含量较高，也有少量的游离脂肪酸和磷脂。在贮藏第3～12天时，图中Ⅰ部分的颜色较第0天有加深的趋势，但不明显，贮存第17天后，图中Ⅰ部分的颜色较第0天明显加深，说明此时远东多线咸鱼已经发生了氧化且产生了极性化合物。利用面积分析软件计算得到的极性化合物含量的结果如图4B所示，远东多线咸鱼在贮藏3 d后的极性化合物含量较第0天显著增加（P＜0.05），之后没有太大波动（P＞0.05），直到第17天后极性化合物含量显著上升（P＜0.05），该结果与图4A中观察到的Ⅰ部分颜色的变化趋势基本一致。

2.5 远东多线咸鱼的POV变化

图5 极性化合物含量与POV的相关性Fig. 5 Correlation between the amount of polar compounds and POV

如图5A所示，随着贮藏时间的延长，曲线呈一定的上升趋势，在第0天的POV较低，仅为6.46 meq/kg，在贮藏第3～12天期间，POV虽有所上升，但均小于15 meq/kg，直到第17天后，POV达到19.07 meq/kg，说明此时鱼肉开始发生氧化。该曲线的变化趋势与图4B中极性化合物曲线的上升趋势较为接近，比较2 种方法测定结果的相关性，发现它们也具有较好的正相关性（R=0.962 5）（图5B）。说明利用TLC-i解析法测定远东多线咸鱼的脂质氧化度是可行的。

2.6 盐渍红鲑极性化合物含量的测定

红鲑，又名红大马哈鱼，广泛分布于从日本北部及俄罗斯至美国华盛顿州的北太平洋水域，是世界著名经济鱼种之一[19]。因其亮丽的红色肉质和平均高达9%的含油量而深受消费者的喜爱[20]。在日本，红鲑去头去脏后常被切成鱼段，经盐渍后冷冻销售。由于不饱和脂肪酸含量较高，在低温贮藏过程中，鱼肉逐步发生氧化酸败，品质逐渐降低[21]。盐渍红鲑在-5 ℃贮藏过程中极性化合物含量的变化如图6A所示。氧气组第0天的展开图谱可以看出，盐渍红鲑脂质中主要以甘油三酯和固醇的含量较高，也有少量的游离脂肪酸、甘油二酯和磷脂。伴随贮藏时间的延长，图中Ⅰ部分的颜色逐渐加深，说明盐渍红鲑发生了氧化酸败且产生了极性化合物。而对照组在－5 ℃贮藏过程中Ⅰ部分的颜色也有加深的趋势，但不如氧气组图谱变化显著。利用面积分析软件计算得到的极性化合物含量如图6B所示，随着贮藏时间的延长，氧气组和对照组的极性化合物含量均呈现逐渐增加的趋势，说明红鲑都发生了不同程度的氧化酸败。其中，氧气组的曲线上升速率快于对照组，在第3周极性化合物的含量已达到8.83%，显著高于对照组（P＜0.05）。

图6 盐渍红鲑贮藏过程中极性化合物含量的变化Fig. 6 Temporal changes in the amount of polar compounds in salted Oncorhynchus nerka during storage

2.7 盐渍红鲑a*值的变化

图7 极性化合物含量与a*值的相关性Fig. 7 Correlation between the amount of polar compounds and a*

由于红鲑体表颜色鲜艳，会对常规POV、TBARS等方法的测定造成干扰，本实验选用a*值来评价盐渍红鲑在-5 ℃贮藏期间体表颜色的变化。如图7A所示，随着贮藏时间的延长，氧气组和对照组的a*值呈一定的下降趋势，在第3周氧气组的a*值显著低于对照组（P＜0.05），说明盐渍红鲑在冷冻过程中橙色的显色物质虾青素等类胡萝卜素物质因氧化而被破坏[21]。该曲线的下降趋势与图6B中极性化合物曲线的上升趋势较为类似，比较2 种方法测定结果的相关性，发现它们具有较好的负相关性（R=-0.822 9）（图7B）。同时，有文献[22]报道三文鱼的a*值与TBARS值有很强的相关性，这些说明了在难以用常规的POV、TBARS等方法测定盐渍红鲑的脂质氧化度中，利用TLC-i解析法测定具有潜在的价值。

3 讨 论

鱼类在贮藏过程中，由于受到酶、微生物、氧等内外因素的影响，极易腐败变质。其中脂肪氧化是导致鱼体腐败变质的主要原因。多不饱和脂肪酸的存在使鱼体即使在低温贮藏过程中易发生脂肪氧化，生成醛、酮、醇等化合物，不仅引起鱼肉质地、风味变差，还缩短了保存期[23-24]。目前大部分的测定方法存在测定程序繁琐、所需化学试剂多、时间长等问题，只适应于实验室检测，难以满足现代社会对食品安全检测技术简便、快速、准确及现场化测定的要求[2]。

以甘油三酯为主成分的脂质在氧化过程中，比甘油三酯极性较强的化合物在逐步形成[25]。食用油在高温煎炸过程中，由于光、热、水及微生物等作用，甘油三酯中不饱和脂肪酸的不饱和键发生氧化、裂解、聚合等一系列反应，生成比甘油三酯极性大的一些化合物[26]。这些极性化合物的含量通常使用传统方法层析柱分离法进行测定，近年来也有运用薄层色谱法通过特定指示剂在各种高温氧化油中的比移值与极性化合物含量的线性关系来进行测定[27]。该指标的检测目前在欧洲已成为煎炸油的管理指标[28]。Kaitaranta等[25]曾利用棒状薄层色谱-氢火焰离子化检测器（thin layer chromatography flame ionization detector，TLC-FID）定量测定在加速氧化过程中鱼油所产生的极性脂质含量，发现极性脂质含量的增多与鱼油质量的增加具有直接的线性关系。木村友紀等[29]也曾利用TLC-FID来测定沙丁鱼油在氧化过程中生成的氢过氧化物及极性更强的二次氧化产物。TLC-FID是将样品液点在专用的色谱棒上，经溶剂展开后，将此色谱棒通过适当的机械传动装置，水平地穿过检测氢火焰的中心，使化合物燃烧裂解，形成离子碎片和自由电子，再由电极收集它们并产生与化合物量呈正比的电流信号而测出各物质的含量[30]。该方法虽然分离效果好，分析精度高，可快速简便地进行脂质成分分析，但需要昂贵的设备来实现操作。本实验以黄鳍金枪鱼油为例建立了TLC-i解析法，鱼油经薄层色谱分离后，将氧化生成的比甘油三酯极性强的化合物利用面积分析软件进行半定量，其结果与POV、CV法相比具有较好的正相关性。同时，利用该法评价了远东多线咸鱼在4 ℃贮藏过程中的脂质氧化度，其结果与POV具有较好的正相关性。评价了盐渍红鲑在-5 ℃贮藏过程中的脂质氧化度，其结果与a*值具有较好的负相关性。说明利用TLC-i解析法评价鱼肉的脂质氧化度是可行的。

该方法与目前常用的脂质氧化评价方法POV相比，鱼油所需量大幅降低，食品安全国家标准食品中POV的滴定法[31]规定每测定一个样品需要鱼油2～3 g，Bilinski等[13]的解析法中鱼油的需要量为50 mg，本实验所开发的TLC-i解析法鱼油需要量仅为0.5 μL，约是国家标准中鱼油需要量的1/4～1/6。同时，该方法所需溶剂量较少，操作简单，多个样品可同时分析，测定时间大大缩短，脂质的氧化情况可从TLC图谱中直观看出。具有简单化、快速化、微量化、可视化的特点。

4 结 论

本实验采用TLC分离、显色、半定量分析处理方法，建立了TLC-i解析法快速测定鱼类氧化生成的极性化合物含量的方法以评价鱼肉的脂质氧化度。取鱼油0.5 μL点样于硅胶板上，用正己烷-乙醚-醋酸（30∶70∶1，V/V）的混合液展开12 min后，3%醋酸铜磷酸溶液喷雾显色，150 ℃加热15 min后，将氧化生成的极性化合物通过面积分析软件进行半定量分析。其结果分别与POV、CV具有较好的相关性，相关系数分别为0.993 8和0.972 5，且具有较好的重复性和稳定性。将此方法用于判定远东多线咸鱼在4 ℃贮藏期间的脂质氧化情况，发现极性化合物含量与POV具有较好的正相关性（R=0.962 5）。将此方法用于判定盐渍红鲑在-5 ℃贮藏期间的脂质氧化情况，发现极性化合物含量与a*值具有较好的负相关性（R= -0.822 9）。这些结果表明，该方法具有简单化、快速化、微量化、可视化的优点，且不需要昂贵的设备，适合鱼肉脂质氧化度的快速评价。

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Rapid Identification of Lipid Oxidation Levels in Fish by Thin Layer Chromatography Image Analysis Technique

YU Hui1, SATO Minoru2, YAMAGUCHI Toshiyasu2, NAKANO Toshiki2
(1. School of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China; 2. Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, Sendai 981-8555, Japan)

In this study, we developed a rapid method to determine the amount of polar compounds generated from lipid oxidation in fish based on thin layer chromatography (TLC) and image analysis in order to identify the extent of lipid oxidation in fish. The chromatographic separation of yellowfin tuna (Thunnus albacores) oil (0.5 μL) was performed on TLC plates using hexane-diethyl ether-acetic acid (30:70:1, V/V) as a mobile phase for 12 min. Color development was carried out by spaying the plates with 3% copper acetate in phosphoric acid and heating them at 150 ℃ for 15 min. The polar compounds derived from lipid oxidation during the heating process were semiquantitatively determined by area calculation with a special software. It was indicated that the amount of polar compounds measured by TLC was highly correlated with two common lipid oxidation parameters of peroxide value (POV) and carbonyl value (CV) with a correlation coefficient (R2) of 0.993 8 and 0.972 5, respectively. Furthermore, a good positive correlation between the measured amount of polar compounds and POV with a correlation coefficient of 0.962 5 was observed for salted Pleurogrammus azonus stored at 4 ℃, while salted sockeye salmon (Oncorhynchus nerka) stored at −5 ℃ showed a good negative correlation between this measured parameter and color parameter a* value with a correlation coefficient of −0.822 9. These results strongly suggest that TLC image analysis has the advantages of simplicity, rapidity, microscale quantitation and easy visualization without the need for expensive equipment.

TLC-i analysis; lipid oxidation; polar compounds; rapid detection

10.7506/spkx1002-6630-201714047

TS207.7

A

1002-6630（2017）14-0304-06

于慧, 佐藤实, 山口敏康, 等. 薄层色谱画像解析法快速判定鱼肉的脂质氧化度[J]. 食品科学, 2017, 38(14): 304-309.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714047. http://www.spkx.net.cn

YU Hui, SATO Minoru, YAMAGUCHI Toshiyasu, et al. Rapid identification of lipid oxidation levels in fish by thin layer chromatography image analysis technique[J]. Food Science, 2017, 38(14): 304-309. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714047. http://www.spkx.net.cn

2017-02-04

教育部留学回国人员科研启动基金项目（第49批）；鲁东大学引进人才项目（LY2013022）

于慧（1982—），女，讲师，博士，研究方向为水产品加工与贮藏。E-mail：zoehuihui@hotmail.com