白芨种子共生及非共生萌发的研究进展

高中南，余磊磊，周京龙，周燚 (长江大学农学院,湖北 荆州 434025)

白芨种子共生及非共生萌发的研究进展

高中南，余磊磊，周京龙，周燚 (长江大学农学院,湖北 荆州 434025)

综述了白芨(Bletillastriata)种子共生萌发的过程与机制、种子的采集与保存、种子的消毒与预处理、非共生萌发的培养基、培养条件及组培苗移栽技术等的研究进展，并对白芨种子萌发研究及白芨工业化生产进行了展望。

白芨(Bletillastriata)；共生萌发；非共生萌发

白芨(Bletillastriata)别名朱兰，为兰科(Orchidaceae)地生型多年生草本球茎植物。花期主要在春季，具有很高的药用及园林价值。主要用于收敛止血、消肿生肌，是我国民间传统的珍贵中药材之一[1]，市场需求量很大。近些年来，在我国白芨被过度采挖，且生长环境被严重破坏，野生白芨资源急聚下降，濒临灭绝，白芨已被我国列为重点保护生物类群。分株繁殖是白芨栽培常用的方法[2]，但分株繁殖周期长，效率低，繁殖力有限，满足不了产业化栽培的需要。白芨亦可采用直播繁殖，但其种子细小如粉且无胚乳，一个果荚常含上万粒种子，数量极多，野生条件下很难萌发，且萌发过程中通常需要共生真菌为其提供营养，种子萌发率非常低[3]。要满足大量栽培的需要，种子萌发是关键所在。笔者对近年来白芨种子萌发相关研究进展进行综述，以为加快白芨产业化步伐提供参考。

1 共生萌发的研究

共生萌发是指在共生菌侵染下种子萌发的过程。白芨种子细小如粉且无胚乳和子叶，其胚无法为种子萌发过程提供足够养分，且种子必须从外界获取萌发所需的营养元素和生长因子[4]。

1.1 真菌对白芨种子萌发的促进作用

19世纪人们证实了兰科植物中存在着共生菌，并证实共生菌能促进兰科种子萌发。同时表明，在野生环境下，白芨种子只有被其共生真菌侵染才能萌发。1992年郭顺星等[5]研究白芨共生萌发特性，发现白芨在常规环境下能顺利发芽，为兰科植物中易萌发的种子类型。种子与真菌拌种播种，可明显加快种子萌发过程中原球茎子叶分化及假根形成。真菌培养后的提取液能促进白芨萌发和生长，表明该菌代谢产物可能含有促进白芨生长的活性养料。真菌拌种和提取液播种效果相似。

1.2 染菌萌发过程中细胞超微结构变化

1990年徐锦堂等[6]研究了白芨共生萌发细胞中微小结构的生长过程。该研究表明，白芨为兰科植物中易萌发种类。胚的大型薄壁细胞中富含淀粉及脂类等贮藏物质，是种子在常规条件下萌发的主要营养来源。种子与真菌拌种播种，被合适的真菌侵染，发芽势会升高，能明显促进原球茎的分化。观察萌发过程中细胞结构发现，真菌首先穿过种皮细胞到达种胚，从胚柄处进入胚细胞，然后散布在胚柄端的几层胚细胞中。胚细胞被真菌侵入后，细胞器和细胞质渐渐变没，质膜内陷生成的囊状体包裹并吸收菌丝中的养分。菌丝经过白芨细胞壁过程中，尖端多半会膨涨变大，依赖其与细胞质作用生成的压力在白芨细胞中穿行。此外少量菌丝的细胞壁会在侵染后显著变厚，用于加厚的营养元素来源于白芨种胚细胞质，这些加厚的菌丝最后会被全部消解，为白芨种子萌发和生长提供养分。真菌即将侵入但还未侵入的白芨细胞显示出很旺盛的代谢活力。

白芨种子染菌萌发中，种子对不同真菌侵入后的反应并非完全一致，适宜的真菌在胚的一定范围细胞中存在，形成彼此营养平衡的共生关系，有利于种子萌发及其后的生长。有些真菌或植物致病菌可使整个白芨种胚充满菌丝，导致种子死亡。

1.3 真菌促进白芨种子萌发的机制

在白芨种子萌发的过程中，白芨种胚中养分往往不够，侵入的真菌可为它提供养分和生长因子等。入侵的真菌不仅能为种子萌发提供所需的营养，而且共生真菌能产生抑制其他微生物生长的活性物质，可大大减少种子被杂菌污染的几率，进而为白芨种子萌发及生长提供良好的环境条件[7～9]。

2 非共生萌发的研究

白芨非共生萌发是指利用组织培养技术，在人工培养基上不外加真菌侵染使白芨种子萌发。非共生萌发能在短时间内得到大批白芨幼苗，是目前成本低、既快速又有效的繁殖方法之一[10～13]。白芨在自然环境或人工培养条件下生长速度都非常慢，繁殖系数也很低。利用组织培养技术促进白芨种子的大量萌发，可以解决分株繁殖系数低、成本高的弊端，并且能在短期内得到大批生长健全的小苗，是一种经济高效的繁殖方式。

2.1 白芨种子的采集与保存

白芨种胚的成熟度决定着非共生萌发的萌发率，种胚的年龄到20 周时开始采收最好，这时种子含胚的几率最大，萌发率接近100%，萌发所需的时间为1 周[14]。最好在白芨种子成熟后但蒴果还未开裂之前进行采集[15]。

温度和种子含水量是影响种子寿命的主要因素。白芨种子在5℃条件下保存为宜。新鲜白芨种子在5℃下储藏最为合适，该温度下存放60d后，种子才开始缓慢减少萌发率，即使150d后种子的萌发率仍接近50%。在5℃和-18℃条件下储存干燥种子，3个月内种子萌发率几乎一样，储存在-18℃的种子的萌发率稍高一点，表明冷冻对干燥的种子的萌发率基本无影响[16]。

2.2 白芨种子的消毒与预处理

未开裂的白芨蒴果常用的消毒方法如下：先使用70%酒精消毒30s，再用0.1%升汞进行消毒15min，或根据实际试验的情况确定消毒时间。也可用2.5%次氯酸钠溶液代替升汞进行消毒。消毒完后再用无菌水冲洗3遍，并用无菌滤纸把水吸干[17]。然后在无菌条件下切开果荚，取出种子，将种子均匀接种到已灭菌的培养基上，实验所用的刀和镊子等都需要经过消毒处理。陈超等[18]研究发现，接种到培养基中的种子数量越多，种子萌发会越迅速，这体现出群体效应。但不宜过密，过密则会得到负面效果。

开裂的白芨蒴果宜用次氯酸钠代替升汞消毒。因为次氯酸钠对细小白芨种子伤害更小，且消毒效果也好。

2.3 非共生萌发的培养基

根据前人的研究，现收集整理部分白芨非共生萌发及生根壮苗培养基配方(表1)。目前比较常用的培养基有MS、改进的MS、KC、N6和RE等。这些培养基一般还加入2%～3%的蔗糖、0.8%左右的琼脂固化，pH还不确定，大多研究认为5.8～6.5较合适。培养基中一般还加入一定浓度的NAA，能提高种子萌发率和萌发速度；关于其中加入6-BA的作用，还存在一定的争议。目前，关于白芨种子萌发最适培养基配方也没有一致的结论。多数研究在培养基中加入了不同的添加剂，常用的添加剂有椰子汁、香蕉汁、菠萝汁、土豆汁等[19]，它们是一类成分复杂的天然复合物，可有效促进种子萌发。一般培养基中还会加入一定量活性碳。一般认为，活性炭能提供暗环境，促进不定根的诱导；还能吸附培养基中酚类等有毒有害物质，有效地防止褐变；也能吸附培养基中的生长调节物[20,21]。

表1 白芨种子非共生萌发培养基配方

2.4 培养条件

兰科植物种子萌发通常采用暗培养或光照强度为1200～2000lx的环境中培养[29,30]。但李雨晴等[31]通过研究发现，黑暗下培养会降低白芨种子的发芽率。培养的温度通常为25℃左右。光照时间通常为12h左右。

2.5 组培苗的移栽

种子萌发后，待幼苗长至2cm左右时，将幼苗转移至生根培养基中诱导生根，待幼苗长至3～5cm时，打开培养瓶瓶盖放在室内自然光下炼苗3d左右[32]，然后取出幼苗，将根部附着的培养基清洗干净，再移栽至育苗基质中，基质为腐质土与蛭石按一定比例混合配制，使用前要先消毒。移栽后适度遮阴，并保持一定的湿润。

3 问题与展望

白芨具有很高的药用价值和经济价值，虽其种子属于兰科中易萌发的类型，但白芨的工业化生产问题仍未解决。

白芨种子共生萌发虽然行之有效，但白芨体内分离的真菌不一定是其种子萌发的共生菌，且共生菌的筛选需要很长时间，共生萌发也较缓慢。不过一旦筛选出效果较好的共生菌，就可进行大规模育苗。通过共生萌发形成的幼苗，成活率也更高。现阶段有关白芨共生菌的研究文献还不够多，也没有效果非常好的共生菌被筛选出来。因此，亟需研究人员筛选出效果较好的种子萌发共生菌。

现阶段研究得较多的是白芨的非共生萌发，非共生萌发操作简便，可在短时期内生产出很多白芨幼苗，但非共生萌发的幼苗移栽的成活率相对较低，且白芨蒴果即使在5℃条件下存放一段时间后也会开裂，开裂后种子的消毒不易把握，消毒过长种子易死；消毒不完全，培养基和种子易被杂菌污染，污染不仅会浪费种子，还会降低白芨幼苗产量。李慧敏等[33]研究发现，含有假鳞茎的白芨组培苗存活率非常高，认为假鳞茎的诱导形成是提高组培苗存活的关键。此外，非共生萌发的最适培养基也没有统一的配方。如何改进培养基配方和培养条件进一步提高萌发率、改进消毒方法减少污染率、改进移栽技术提高幼苗成活率仍需进一步研究。

2种萌发方法都有不足之处，基于此，有研究者提出了原地共生萌发法。白芨原地共生萌发法是指将白芨种子装在特殊的袋子中，然后埋到白芨原来的野生生长环境中，一段时间后察看白芨种子萌发与否，并检测细胞是否被真菌侵入[34]。该技术在国外已被用于兰科植物种群保育，维持兰科植物种群发展，但国内还未广泛运用。

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[编辑] 余文斌

2017-02-26

湖北省农业创新基地项目(2010CBB03801)；湖北省科技厅重点基金项目(2015000384)。

高中南(1991-)，男，硕士生，研究方向为植物病害与生物防治。通信作者：周燚，zhouyi@yangtzeu.edu.cn。

Q949.71+8.43

A

1673-1409(2017)14-0058-04

[引著格式]高中南，余磊磊，周京龙，等.白芨种子共生及非共生萌发的研究进展[J].长江大学学报(自科版) ，2017，14(14)：58～61.