黄腐酸促进超氧化物歧化酶形成的作用机制探究

张彩凤 吴云彬 宋 珍

黄腐酸促进超氧化物歧化酶形成的作用机制探究

张彩凤1,2吴云彬1宋 珍1

(1 太原师范学院化学系 晋中 030619 2 山西省腐植酸工程技术研究中心 晋中 030619)摘 要：本论文利用Discovery Studio 4.5初步探讨了腐植酸中的黄腐酸促进超氧化物歧化酶形成的作用机制。黄腐酸作为一种生物刺激素已被广泛的应用于农业生产，并且很多研究表明，黄腐酸在植物的许多生理过程中起了非常重要的作用。实验数据显示，在一定浓度范围内，黄腐酸对玉米幼苗叶片中超氧化物歧化酶的形成有一定的促进作用。通过分子模拟软件Discovery Studio 4.5对机理的研究表明，这是由于黄腐酸先与植物中的钙调蛋白结合，形成较为稳定的配合物，后再与超氧化物歧化酶作用，降低了酶本身的能量，不仅使其更容易被合成，同时还增加了它与其他物质的亲和力。

腐植酸 黄腐酸 钙调蛋白 超氧化物歧化酶(SOD)

腐植酸(Humic acid，HA)，是一种在自然界中普遍存在且较为易得的大分子有机物，它是动、植物遗骸经过十分漫长的地质过程，并由一系列微生物分解转化而形成的一种天然有机质。腐植酸的种类有很多，其中黄腐酸由于其较小的分子量，非常容易被生物吸收。除此，腐植酸还含有较多的活性基团，如酮羰基和酚羟基，因此易于以氢键的形式与大分子物质结合，而这一点又非常有利于我们进行接下来的一系列探究。

大量的研究表明，将黄腐酸培养液喷洒在农作物的表面，能够显著地提高被喷洒农作物的产量[1～3]，而对于农作物以外的其他植物，则可以非常明显地促进其生长发育[4]。与此同时，大量的研究实例也证明，黄腐酸在植物的养分转化方面具有一定的促进作用，如作为一种新型的生物刺激素，它能够刺激植物体内酶的活性，特别是对植物细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及过氧化物酶(POD)具有明显的作用[5～8]。实验数据显示，在一定范围内，随着黄腐酸浓度的增加，玉米幼苗叶片中SOD的含量也呈现增加的趋势[9]。

而据文献显示，广泛存在于植物体内的一种受体蛋白——钙调蛋白可以刺激SOD的生成[10]。钙调蛋白是一种钙受体蛋白，它可以通过与钙离子的结合，形成钙-钙调蛋白复合物(Calcium-Calmodulin Complex)。与此同时，钙调蛋白的构型也会相对地发生一些变化，成为一些酶如SOD的激活物。SOD被激活后，它便能更好地催化如下反应的进行：2O2-+2H+→H2O2+O2。这样一来，存在于生物体内的有害物质——超氧阴离子自由基就可以得到很好的清除[10]，因为超氧阴离子O2-的浓度过高会导致氧化从而损坏生物自身组织[11]，所以其累积含量越少对植物的生长越有利。

因此，玉米幼苗叶片中SOD含量的增加与黄腐酸和钙调蛋白有关，但由于黄腐酸也可以与钙调蛋白发生相互作用[9]，所以就目前的研究来看是无法确定其作用机制在三者都参与的情况下具体是按怎样的途径来进行的。由此可提出以下三种假设来进行机理的探讨。

第一，黄腐酸与钙调蛋白形成配合物后再与SOD相互作用；

第二，钙调蛋白直接与黄腐酸-SOD配合物相互作用；

第三，黄腐酸-钙调蛋白配合物与黄腐酸-SOD配合物发生相互作用。

但想要证明这些，通过宏观的实验是无法做到的，必须从微观的角度来进行。因此，本论文利用近些年来被广泛使用的基于统计力学和量子力学[12]的计算机分子模拟技术，通过Discovery Studio 4.5软件，从以上的三种假设出发，用分子对接(Molecular Docking)、结合能(Binding Energy)计算以及分子动力学(Molecular Dynamics，MD)模拟来初步探讨黄腐酸促进SOD形成的作用机制。

1 实验部分

1.1 实验材料

本论文中对接所使用的黄腐酸3D模型来自PUBCHEM数据库，钙调蛋白和SOD的3D模型则来自PDB数据库。此次实验用马铃薯的钙调蛋白、番茄的SOD来近似代替所有植物的这两种蛋白结构进行计算机分子模拟。

1.2 材料的预处理

对于直接从PUBCHEM数据库中下载所得的黄腐酸分子，要先在Small Molecules中进行优化(Full Minimization)，目的是将其优化为能量最低的合理构象，然后通过Prepare or Filter Ligands面板，找到其可能存在的、所有的同分异构体，为下一步分子对接(Molecular Docking)做准备。

对于直接从PDB数据库中下载所得的钙调蛋白和SOD，则要先去除蛋白质所携带的水分子，然后点击软件的Prepare Protein面板，使系统自动优化和补全蛋白结构，最后通过From Receptor Cavities选项，找到蛋白质的活性位点(即最有可能与配合物或是另一蛋白质发生相互作用或结合的部位。多数情况下，软件会定位于蛋白质的空腔部分)，为下一步的分子对接(Molecular Docking)做准备。

1.3 实验方法

1.3.1 实验所用软件

本论文进行计算机分子模拟所用的软件为美国Accery 公司自主研发的Discovery Studio 4.5，即药物发现与生物大分子计算模拟平台4.5版本。Discovery Studio(简称DS)，它主要服务于生命科学领域，用于蛋白质结构的研究及新药的发现。它主要包含四大板块：生物大分子板块(如蛋白质中氨基酸的序列分析、蛋白质结构的优化和活性位点的预测等)、计算化学板块(如分子动力学计算以及分子动力学模拟等)、基于靶标结构药物设计板块(如基于靶标结构的化合物虚拟筛选以及蛋白与蛋白、蛋白与有机化合物配体的对接等)和基于配体药物设计板块。

1.3.2 小分子与大分子的对接及动力学模拟

小分子与大分子对接所依据的原理为Fischer E所提出的锁匙原理，根据CHARMm力场(简单点说其实就是几何匹配和能量匹配)，寻找两分子间的最佳匹配(互相作用)模式。在这里小分子指的是黄腐酸，大分子则是指钙调蛋白以及SOD。在软件的Receptor-Ligand Interactions面板中找到Dock Ligands(CDOCKER)选项设置好对接参数，然后点击RUN开始运行，数分钟后，即可得到对接结果。

将对接好的黄腐酸-钙调蛋白和黄腐酸-SOD配合物根据牛顿力学来进行分子动力学模拟，它主要包括以下四个过程：模拟体系的升温过程(Heating Stage)、模拟体系的平衡过程(Equilibrium Stage)、模拟体系的采样过程(Production Stage)以及分析体系的目标性质(Analysis)。然后在Simulations面板中溶剂化蛋白、设置束缚和修改动力学参数，最后点击RUN开始运行，数小时后即可得到模拟结果。

1.3.3 大分子与大分子的对接

大分子与大分子对接所依据的原理仍为锁匙原理，但有所不同的是，它是基于快速傅立叶转化相关性技术的一种刚性蛋白对接算法。算法中快速傅立叶转化相关性技术被用于搜索蛋白-蛋白对接系统的平动和转动空间。此次实验采用的采样角度为6度，由于角度较小，因此采样较多，预测结果也更为准确。在这里，大分子指的是钙调蛋白和SOD，或是黄腐酸-钙调蛋白和黄腐酸-SOD配合物。在软件的Macromolecules面板中找到Dock Protein(ZDOCKER)选项设置的对接参数，然后点击RUN开始运行，数小时后，即可得到对接结果。

1.3.4 结合能的计算

在软件的Receptor-Ligand Interactions面板中找到Calculate Binding Energy选项，然后点击计算结合能。

1.4 数据处理

在View Result中调出计算数据与图表，分析所得结果。

2 结果分析

2.1 黄腐酸-钙调蛋白及黄腐酸-SOD配合物和它们的动力学模拟

近年来，随着消费升级的不断深入，格兰仕顺应市场需求，也凭借着强大的研发、制造能力，不断推出了一系列的高端家电产品，其中双变频微波炉及微蒸烤一体机更是其突出的代表性产品。

从图1可以看出，黄腐酸分子中一共有4个羟基，2个羰基及2个含氧环，它们都是能够形成氢键的基团。而图2中所显示的黄腐酸分子能够给出或是接受H的部分与它所含有的基团都是相对应的，如：粉色代表能够给出氢的部分，从2D效果图可以看出这是羟基所在的位置；绿色代表能够接受氢的部分，从2D效果图可以看出这是羰基和含氧环所在的位置。

图1 黄腐酸分子(2D)Fig.1 Fulvic acid(2D)

图2 黄腐酸分子表面能形成氢键区域示意图Fig.2 The area of fulvic acid which can form hydrogen bonds with other macromolecular substances

图2 黄腐酸分子表面能形成氢键区域示意图

Fig.2 The area of fulvic acid which can form hydrogen bonds with other macromolecular substances

图3和图4分别是黄腐酸与钙调蛋白和SOD的对接结果示意图，图中红色区域为最有可能的活性位点，绿色部分的作用则如同数学中的坐标一样，黄腐酸分子就是在其中按“坐标”逐个移动以寻找最佳(即不仅能量最低且又具有一定的合理性)的对接部位。

图5显示的是黄腐酸与钙调蛋白对接后两者的非键作用，圆圈部分为与黄腐酸产生非键作用的钙调蛋白中的氨基酸，不同的颜色表示键的类型不同。由图可知，有电荷间的吸引力、氢键、碳氢键、π-烷基键及π-σ键；图6显示的是黄腐酸与SOD对接后两者的非键作用，由图可知，有碳氢键、π-烷基键及π-S键。结合图1和图2可知，图5和6中所提到的那些键大都与羰基、羟基、含氧环中的氧及苯环上的大π键有关，据此可以推断，对于黄腐酸分子，不论是与生物大分子进行对接还是与其他有机物发生反应，主要都是与它所含的以上基团作用。

图3 钙调蛋白和黄腐酸对接示意图Fig.3 Results of docking (the fulvic acid was combined with calmodulin)

图4 SOD和黄腐酸对接示意图Fig.4 Results of docking (the fulvic acid was combined with SOD)

图5 黄腐酸与钙调蛋白对接后两者非键作用示意图Fig.5 Non-bond interaction of fulvic acid-calmodulin compound

图6 黄腐酸与SOD对接后两者非键作用示意图Fig.6 Non-bond interaction of fulvic acid-SOD compound

由图7可知，随着温度的增加，体系的总能量总体来讲是呈下降趋势的，能量越低，物质本身便越稳定。而与此同时，对于钙调蛋白来说，能量的降低也有利于它与其他物质的结合。通过软件计算可知：非活性钙调蛋白与Ca2+的结合能是-349.32 kcal/mol，与黄腐酸分子结合后再与Ca2+结合的结合能是-357.05 kcal/mol，可以看出结合能有所下降，由此可推断黄腐酸可以促进非活性的钙调蛋白向活性构象转变，从而能够促进生物体内与钙调蛋白有关的生理活动的进行，如刺激SOD的生成，利于植物的生长,提高植物的抗逆性能。

图7 黄腐酸-钙调蛋白配合物的动力学模拟结果Fig.7 Results of dynamics simulation (fulvic acid was combined with calmodulin)

图8为黄腐酸-SOD配合物进行动力学模拟后所得的结果。由图可知，随着温度的增加，体系的总能量与开始相比最终也是呈下降趋势的，这就说明配合物的构型也变得更加稳定了。通过软件计算可知：未与黄腐酸分子对接前，SOD的能量为-3517.1514 kcal/mol，而与黄腐酸分子对接后SOD自身的的能量变为-3632.9798 kcal/mol，能量有所下降，但是下降的并不是十分明显，因此还需通过接下来的计算来证明到底哪种作用机理更为合理。

图8 黄腐酸-SOD配合物的动力学模拟结果Fig.8 Results of dynamics simulation (fulvic acid was combined with SOD)

2.2 大分子-大分子复合物和结果分析

图9 SOD为受体,钙调蛋白为配体进行分子对接结果示意图Fig.9 SOD as a receptor, calmodulin as a ligand, the calmodulin was combined with SOD

图10 已与黄腐酸对接的SOD为受体,钙调蛋白为配体进行分子对接结果示意图Fig.10 Fulvic acid- SOD compound as a receptor, calmodulin as a ligand, the calmodulin was combined with fulvic acid-SOD

图11 SOD为受体,已与黄腐酸对接的钙调蛋白为配体进行分子对接结果示意图Fig.11 SOD as a receptor, fulvic acid-calmodulin compound as a ligand, the fulvic acid-calmodulin compound was combined with SOD

图12 已与黄腐酸对接的SOD为受体，已与黄腐酸对接的钙调蛋白为配体进行分子对接结果示意图Fig.12 Fulvic acid-SOD compound as a receptor, fulvic acid-calmodulin compound as a ligand, the fulvic acid-calmodulin compound was combined with fulvic acid-SOD

比较黄腐酸-SOD配合物和黄腐酸-钙调蛋白配合物的结合能，-106.69 kcal/mol和-357.05 kcal/mol，可看出后者比前者构象更加稳定，因此黄腐酸更易于与钙调蛋白结合形成配合物。

由以上数据可知：黄腐酸促进植物体内SOD的形成最可能的途径是：黄腐酸先与钙调蛋白结合再与SOD作用，因为从能量的角度来看，这样所需的能量最低，反应也更容易朝此方向进行。

3 结论

大田实验结果显示，黄腐酸能够作为一种生物刺激素作用于植物，而且用黄腐酸培养液培育的植物，其细胞质中SOD的含量明显增加，而这种酶的增多对于植物体内超氧自由基的清除又有很明显的促进作用[13-15]，同时还可以增加植物的抗逆性。本论文计算机分子模拟的计算结果表明，黄腐酸促进植物体内SOD的形成最有可能的机理是：黄腐酸先与钙调蛋白结合，形成较为稳定配合物，后再与SOD作用，降低了酶本身的能量，从而增强了其与其他物质作用时的亲和力。与此同时，由于沿此途径形成的酶的能量较低，因而也有利于刺激植物体内SOD的形成。

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A Preliminary Study on the Mechanism of Formation of Superoxide Dismutase Affected by Fulvic Acid

Zhang Caifeng1,2, Wu Yunbin1, Song Zhen1
(1 Taiyuan Normal University, Jinzhong, 030619 2 Humic Acid Engineering and Technology Research Center of Shanxi Province, Jinzhong, 030619)

A study on the formation mechanism of superoxide dismutase (SOD) was conducted. The result showed that the formation of superoxide dismutase in plant’s leaves was promoted by fulvic acid to some extent. The molecular simulation analysis indicated that fulvic acid could reduce the binding energy between the calmodulin and Ca2+to make calmodulin becoming easier to be activated.

humic acid; fulvic acid; calmodulin; superoxide dismutase(SOD)

TQ314.1，Q554

1671-9212(2017)03-0056-06

A

10.19451/j.cnki.issn1671-9212.2017.03.006

国家自然科学基金(批准号：51174275)、山西省留学归国基金资助(No.2011085)和太原师范学院大学生创新项目(CXCY1606)资助。

2017-5-25

张彩凤，女，1964年生，教授，主要从事腐植酸生物功能方面研究，E-mail：841322483@qq.com。