宫颈上皮内瘤变组织中高危型HPV感染对凋亡、增殖基因表达的影响

陶旻枫++王小榕

[摘要] 目的 研究宫颈上皮内瘤变（CIN）组织中高危型HPV感染对凋亡、增殖基因表达的影响。 方法 选择2013年5月～2016年10月在首都医科大学附属北京妇产医院北京妇幼保健院进行活检的CIN组织和炎性病变组织，分别作为CIN组和对照组。测定高危型HPV感染情况，根据HPV-DNA的RLU/CO将CIN组织分为<1 RLU/CO组、1～100 RLU/CO组、>100～1000 RLU/CO組、>1000 RLU/CO组。同时，测定宫颈组织中细胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白的表达量。 结果 CIN组宫颈组织中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表达量显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。1～100 RLU/CO组、>100～1000 RLU/CO组、>1000 RLU/CO组CIN组织中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表达量显著高于<1 RLU/CO组，且HPV-DNA的RLU/CO越高，cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表达量越高，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 宫颈上皮内瘤变组织中高危型HPV感染能够增加细胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白的基因表达量。

[关键词] 宫颈上皮内瘤变；高危型人乳头瘤病毒；细胞周期；凋亡抑制蛋白

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（b）-0080-05

Effect of high risk HPV infection on the genes expression of apoptosis and proliferation in cervical intraepithelial neoplasia

TAO Minfeng1 WANG Xiaorong2

1.Health Department， Beijing Maternal and Child Health Care Hospital， Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital， Capital Medical University， Beijing 100026， China； 2.Department of Perinatal Medicine， Beijing Maternal and Child Health Care Hospital， Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital， Capital Medical University， Beijing 100026， China

[Abstract] Objective To study the effect of high risk HPV infection on the expression of apoptosis and proliferation genes in cervical intraepithelial neoplasia （CIN）. Methods CIN tissues and inflammatory lesions tissues received biopsy in Beijing Maternal and Child Health Care Hospital， Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital， Capital Medical University from May 2013 to December 2016 were collected， respectively enrolled in CIN group and control group. CIN tissues were divided into <1 RLU/CO group， 1-100 RLU/CO group， >100-1000 RLU/CO group， >1000 RLU/CO group according to HPV-DNA RLU/CO. Meanwhile， cell cycle protein and its kinase， inhibitor of apoptosis proteins in cervical tissue were determined. Results Expression levels of cyclinB1， cyclinD1， cyclinE， CDK4， CDK6， Apollon， c-IAP1， Survivin， Livin mRNA in cervical tissue of CIN group were significantly higher than those of control group， with statistically significant differences （P < 0.05）. Expression levels of cyclinB1， cyclinD1， cyclinE， CDK4， CDK6， Apollon， c-IAP1， Survivin， Livin mRNA in CIN cervical tissue of 1-100 RLU/CO group， >100-1000 RLU/CO group， >1000 RLU/CO group were significantly higher than those of the <1 RLU/CO group， and the higher the HPV-DNA RLU/CO， the higher the expression of cyclinB1， cyclinD1， cyclinE， CDK4， CDK6， Apollon， c-IAP1， Survivin， Livin mRNA， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion High risk HPV infection in cervical intraepithelial neoplasia can increase the expression of cyclin and its kinase and inhibitor of apoptosis protein genes.

[Key words] Cervical intraepithelial neoplasia； High risk human papilloma virus； Cell cycle； Inhibitor of apoptosis protein

宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是宮颈癌的癌前病变，人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染，尤其是高危型HPV感染是造成CIN的明确危险因素[1-2]。HPV是一类球形DNA病毒，感染局部组织后能够整合进入宿主细胞的基因组DNA，进而引起宿主细胞增殖、凋亡等多种生物学行为的改变[3-5]。但是，目前关于高危型HPV感染引起宫颈上皮细胞增殖、凋亡等生物学过程异常的分子机制并未完全阐明。细胞的凋亡和增殖过程受到多种基因表达产物调控，细胞周期蛋白及相应的激酶通过加速细胞周期促进细胞增殖，凋亡抑制蛋白通过抑制细胞凋亡促进细胞增殖。本研究检测了宫颈上皮内瘤变组织中凋亡、增殖基因的表达量以及高危型HPV感染对凋亡、增殖基因表达的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

实验标本取自2013年5月～2016年10月在首都医科大学附属北京妇产医院北京妇幼保健院进行活检的子宫颈组织，均经病理学检查明确诊断，CIN组织作为CIN组，炎性病变组织作为对照组。CIN组68例，年龄32～58岁，平均（39.5±6.2）岁；CIN Ⅰ期22例，CIN Ⅱ期29例，CIN Ⅲ期17例；体重指数（BMI）为（22.8±3.2）kg/m2。对照组50例，年龄29～60岁，平均（40.2±6.6）岁；BMI为（23.1±3.7）kg/m2。两组患者年龄、BMI等一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 试剂 HPV核酸检测试剂盒（HC-2法）购买于深圳凯杰生物工程公司，Trizol裂解液购买于Invitrogen公司，RNA分离提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒以及荧光定量PCR试剂盒购买于北京天根生物公司。

1.2.2 高危型HPV检测 取30～50 mg宫颈组织，采用HPV核酸检测试剂盒（HC-2法）检测样本发光单位RLU，计算RLU与标准阳性对照临界值CO的比值，将RLU/CO>1.0的样本判断为HPV-DNA阳性。所选用的试剂盒能检测HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68共13种高危型HPV DNA。根据RLU/CO将CIN标本分为<1 RLU/CO组、1～100 RLU/CO组、>100～1000 RLU/CO组、>1000 RLU/CO组。

1.2.3 基因检测 取30～50 mg宫颈组织，加入1 mL Trizol裂解液充分研磨组织，采用RNA分离提取试剂盒分离得到组织研磨液中的总RNA，采用cDNA第一链合成试剂盒将总RNA反转录为cDNA。取cDNA样本并进行荧光定量PCR扩增，所用试剂为荧光定量PCR试剂盒，扩增的基因包括cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin以及GAPDH，引物序列及产物长度见表1，PCR条件见表2，均进行40个循环。得到扩增曲线后以GAPDH为内参计算cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIN组织和正常宫颈组织中细胞周期蛋白及其激酶mRNA表达量

CIN组中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6 mRNA表达量显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 不同高危型HPV感染情况CIN组织中细胞周期蛋白及其激酶mRNA表达量

高危型HPV感染的RLU/CO比值越高，CIN组织中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6 mRNA表达量越高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。

2.3 CIN组织和正常宫颈组织中凋亡抑制蛋白mRNA表达量

CIN组中Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表达量显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.4 不同高危型HPV感染情况CIN组织中凋亡抑制蛋白mRNA表达量

高危型HPV感染的RLU/CO比值越高，CIN组织中Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表达量越高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表6。

3 讨论

CIN是宫颈癌的癌前病变类型，宫颈上皮细胞增殖和凋亡过程异常，细胞不断增殖并向恶性表现转化。细胞周期蛋白及其激酶是调节细胞周期进程以及细胞增殖的重要分子[6-7]。HPV的E1、E4、E7等蛋白能够与pPb结合并使其激活，进而增加转录因子E2F的活性并启动cyclinB1、cyclinD1、cyclinE多种细胞周期蛋白的表达[8-9]。上述细胞周期蛋白与其激酶CDK4、CDK6结合形成复合物后能够促进细胞周期的运行以及细胞的增殖[10-12]。本研究对CIN组织中上述细胞周期蛋白及其激酶mRNA表达量的分析表明：CIN组宫颈组织中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6 mRNA表达量显著高于对照组（P < 0.05）。提示细胞周期蛋白cyclinB1、cyclinD1、cyclinE以及激酶CDK4、CDK6的高表达与CIN的发生有关，CIN组织中细胞周期蛋白及其激酶形成复合体后能够加速细胞周期发展，促进细胞增殖。

在恶性肿瘤及癌前病变的发生和发展过程中，细胞恶性变的过程不仅与细胞周期进程的加速有关，还与多种凋亡抑制蛋白表达增加有关。Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin是与宫颈病变密切相关的几种凋亡抑制蛋白。Apollon是新发现的凋亡抑制蛋白，具有BIR结构域和泛素结合结构域，能够抑制Smac所诱导的细胞凋亡以及caspase-9所介导的细胞凋亡[13-14]。c-IAP1能够与TRAF结合并启动泛素化过程，进而释放活化的NF-κB因子并促进细胞存活[15]。Survivin和Livin均能够与caspase家族中的caspase-3、caspase-7结合并抑制细胞凋亡[16-17]。本研究对CIN组织中上述凋亡抑制蛋白mRNA表达量的分析表明：CIN组宫颈组织中Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表达量显著高于对照组（P < 0.05）。说明凋亡抑制蛋白Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin的高表达与CIN的发生有关，CIN组织中多种凋亡抑制蛋白表达的增加会造成宫颈上皮组织中细胞凋亡过程受到抑制，进而造成细胞异常增殖。

高危型HPV感染与CIN及宫颈癌之间的密切相关已经得到了一致认可，宫颈组织中持续感染的高危型HPV能够将病毒本身的DNA整合进入宿主细胞的基因组DNA，造成宿主細胞多种基因表达改变，进而导致宿主细胞生物学行为的改变[18-24]。但是，目前关于宫颈上皮内瘤变组织中受到高危型HPV影响的基因尚未明确。本研究中，为了明确高危型HPV感染对CIN组织中细胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白表达的影响，按照HPV-DNA的RLU/CO将CIN组织分为四组并分析了细胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白mRNA表达量。结果显示：高危型HPV感染的RLU/CO比值越高，CIN组织中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livinn mRNA表达量越多。说明高危型HPV感染与CIN组织中细胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白mRNA的高表达有关，HPV感染能够增加CIN组织中上述基因的表达量。

综上所述，本研究认为，CIN组织中高危型HPV感染能够增加细胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白mRNA的表达量。但是由于临床样本量较少，仍需通过后续增加样本量来进一步验证和明确上述研究结论。

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（收稿日期：2017-03-01 本文编辑：程 铭）