1，25（OH）2D3对人白血病6T—CEM细胞株凋亡及VDR蛋白表达的影响

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[摘要] 目的 探讨1，25-二羟维生素D3[1，25（OH）2D3]对人白血病6T-CEM细胞株凋亡及维生素D受体（VDR）蛋白表达的影响。 方法 培养6T-CEM细胞株，采用随机数字表法将其分为A、B、C、D四组，A、B、C组分别加入浓度为10-6、10-7、10-8 mol/L的1，25（OH）2D3，D组加入DMSO。采用MTT法检测各组吸光度A值和细胞增殖抑制率情况，AO-EB荧光染色观察各组细胞形态，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，RT-PCR和Western blot法检测VDR mRNA和蛋白表达。 结果 A组吸光度A值明显低于B、C组和D组（P < 0.05）；A、B、C三组的细胞增殖抑制率从高到低依次排序为A>B>C；D组CEM细胞凋亡指数明显低于A、B、C组（P < 0.05）；A组凋亡指数明显高于其他三组（P < 0.05）；各组VDR mRNA表达差异无统计学意义（P > 0.05）；A组VDR蛋白表达明显高于其他三组（P < 0.05）。 结论 1，25（OH）2D3能有效抑制6T-CEM细胞增殖，诱导其凋亡，上调VDR蛋白表达。

[关键词] 白血病；6T-CEM细胞株；1，25-二羟维生素D3；维生素D受体

[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（c）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of 1， 25-dihydroxyvitamin D3 [1， 25 （OH）2D3] on apoptosis of 6T-CEM cell lines and expression of vitamin D receptor （VDR） protein human leukemia. Methods The 6T-CEM cell lines were cultured and randomly divided into group A， B， C， D. Group A， B， C were added with 1， 25 （OH）2D3 with the concentration of 10-6， 10-7， 10-8 mol/L respectively， and group D was added with DMSO. The absorbance A value and cell proliferation inhibition rate were detected by MTT method， the cell morphology was observed by AO-EB fluorescence staining， and the cell apoptosis was detected by flow cytometer， the expression of VDR mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blot method. Results The absorbance of group A was apparently lower than that of group B， C and D （P < 0.05）； the inhibitory rate of cell proliferation of group A， B， C was A>B>C； the CEM cell apoptosis index of group D was apparently lower than that of group A， B and C （P < 0.05）； the apoptosis index of group A was apparently higher than other three groups （P < 0.05）； there was no statistically significant difference in VDR mRNA expression among the four groups （P > 0.05）. The VDR protein expression of group A was apparently higher than that of other three groups （P < 0.05）. Conclusion 1， 25 （OH）2D3 can effectively inhibit the proliferation of 6T-CEM cells， induce its apoptosis， up-regulate the VDR protein expression.

[Key words] Leukemia； 6T-CEM cell lines； 1， 25-dihydroxyvitamin D3； Vitamin D receptor

白血病是一種恶性的造血干细胞克隆性疾病，也是目前最为常见和最具威胁的血液系统疾病[1-2]。该病的发病机制较为复杂，一般认为与多个基因的调控异常有关[3]。目前临床上多采用基因靶向药物治疗慢性粒细胞白血病，虽然取得了一定的效果，但其分子靶点具有一定的局限性，对一些急变期慢性粒细胞白血病患者的治疗效果较差[4-5]。1，25-二羟维生素D3[1，25（OH）2D3]是维生素D在机体中主要的活性产物，不但具有调节钙磷代谢平衡的作用，还能诱导肿瘤细胞分化并抑制肿瘤细胞增殖，其目前是肿瘤研究的热点之一[6-7]。本研究选取人白血病6T-CEM细胞株作为研究对象，探讨分析了1，25（OH）2D3对人白血病6T-CEM细胞株凋亡及维生素D受体（VDR）蛋白表达的影响，为临床上寻找更好的分子靶点治疗白血病提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人急性T淋巴细胞白血病细胞株6T-CEM由中国科学院上海生命科学研究所提供，置于-80℃冰箱中保存。培养方法如下：将菌株取出后于37℃迅速融化，以1000 r/min离心（离心半径为3 cm）5 min后弃上清液，利用培养液洗涤后加入含10%胎牛血清的DMEM培养液进行重悬，于37℃、5%CO2条件下培养，每2～3天换液并传代1次。

1.2 实验分组

将CEM细胞悬液密度调整为2.0×105/mL，接种于96孔培养板，每孔200 μL，采用随机数字表法将实验分为A、B、C、D四组，A、B、C组分别加入以DMSO稀释的浓度为10-6、10-7、10-8 mol/L的1，25（OH）2D3各100 μL，D组加入100 μL DMSO，每组设3个复孔。

1.3 MTT检测细胞增殖

取各组细胞悬液加入MTT（5 mg/mL）孵育4 h，随后加入DMSO进行溶解并沉淀，利用酶标仪在490 nm波长测定各孔的吸光值（A），每组实验重复3次。细胞增殖抑制率=（对照孔平均OD值-用药孔平均OD值）/对照孔平均OD值×100%，实验重复3次。

1.4 AO-EB染色观察细胞形态

取各组细胞悬液加吖啶橙和溴化乙啶（AO-EB）染液进行复合染色，并于3 min内以荧光显微镜（Axioskop40，德国Zesis公司）进行观察，发射波长分别为红色荧光（600 nm）和绿光（550 nm），每个视野内随机计数200个细胞来计算细胞凋亡指数，公式如下：细胞凋亡指数（%）=（早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞）/全部细胞×100%，每组实验重复3次。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

将各组细胞悬液以PBS洗涤后再加入体积分数为0.7的乙醇4℃固定过夜，加入20 μg/mL的RNase，37℃条件下处理30 min，过滤后加入5 μL AnnexinV-FITC和100 μg/mL的PI染液染色30 min，最后以流式细胞仪（FACSCalibur，BD公司）进行检测。

1.6 RT-PCR检测VDR mRNA表达

将各组细胞悬液以RNA提取试剂盒提取总RNA，加入逆转录试剂盒进行逆转录，随后利用RT-PCR试剂盒和荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司，7900FS）定量检测VDR mRNA的表达情况，RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒均购自美国Epitomics公司，具体检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 Western blot检测VDR蛋白表达

将各组细胞抽提蛋白后取约50 μg于聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，2 h后转移至聚亚乙烯双氧化物膜上，5%脱脂奶粉孵育过夜。先加入1∶1000的一抗（Anti-VDR Ab）稀释液于4℃条件下孵育过夜，再加入1∶5000的二抗（HRP标记的羊抗鼠IgG）稀释液于室温下孵育1 h，加入电化学分析剂后暗室显影和定影，采用软件进行灰度值分析，计算VDR蛋白与β-actin的灰度比值。

1.8 统计学方法

数据整理分析采用SPSS 19.0软件，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较使用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CEM细胞的MTT检测情况

A组的吸光度A值明显低于B、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）。A、B、C三组的细胞增殖抑制率从高到低依次排序为A>B>C。见表1。

2.2 CEM细胞形态特征

AO-EB复合染色结果，细胞核或细胞浆呈致密浓染或碎片呈黄绿色荧光者即为凋亡细胞，同时细胞核呈红色荧光者即为坏死细胞。可见A组正常细胞少见，B组正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞并存，C组可见少数凋亡细胞，D组细胞大小形态均一，胞核及胞浆呈均匀黄绿色荧光。见图1（封三）。

2.3 CEM细胞凋亡情况

A组CEM细胞凋亡指数为（41.23±4.10）%，B组为（30.05±2.84）%，C组为（24.38±1.46）%，D组为（11.50±0.07）%，四组两两比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。其中A、B、C組分别与D组比较，t = 13.283、10.382和9.894，P < 0.05；A、B组分别与C组比较，t = 11.034、7.382，P < 0.05；A组与B组比较，t = 9.372，P < 0.05。见图2（封三）。

2.4 VDR mRNA和蛋白表达情况

各组VDR mRNA表达差异无统计学意义（P > 0.05）。A组VDR蛋白表达明显高于其他三组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2、图3～4。

3 讨论

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，主要是指克隆性白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等，并在骨髓和其他造血组织中大量累积，浸润其他非造血组织和器官，进而抑制正常造血功能的疾病，患者的临床表现多为不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛等[8-10]。我国白血病的发病率较高，在各种肿瘤中占第6位，发病原因分为病毒、化学、放射、遗传等因素，临床上多依据起病的缓急分为急性和慢性白血病两种。目前临床上并没有统一的治疗方式，常用的方法有化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗、干细胞移植等，且已取得了良好的治疗效果，患者的预后得到了明显的改善[11]。但同时也有研究表明[12]，大剂量化疗药物治疗虽然能改善患者的症状，但长期用药的不良反应较大，患者的依从性也较差，因此寻找新的、特异性高、不良反应小的药物是目前医学关注的重点和难点。近年来，1，25（OH）2D3抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的作用备受关注，已有不少学者将1，25（OH）2D3应用于肠癌、乳腺癌细胞、急性髓性白血病等的治疗过程中，并取得了一定的效果[13-16]。1，25（OH）2D3是人体必需维生素，又称为骨化三醇，也是维生素D在人体内的活化形式，其不但可以维持体内钙环境相对稳定，还可调节多种细胞的增殖、分化。为了进一步探讨其作用机制，本研究选取人白血病6T-CEM细胞株作为研究对象，探讨分析不同浓度的1，25（OH）2D3对人白血病6T-CEM细胞株凋亡及VDR和蛋白表达的影响。

本研究结果发现，A、B、C组测得吸光度A值均明显低于D组，且A组最低；计算细胞增殖抑制率发现，A、B、C组细胞增殖抑制率分别为63.53%、27.27%和7.03%，提示1，25（OH）2D3對人白血病6T-CEM细胞的增殖具有一定的抑制作用，且随着1，25（OH）2D3浓度的升高，抑制作用则明显提升。将各组细胞进行染色后观察发现，A组内几乎全为凋亡和坏死细胞，而B组内正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞并存，C组仅有少量凋亡细胞，D组内几乎全为正常细胞，提示1，25（OH）2D3具有诱导人白血病6T-CEM细胞株凋亡的作用，且随着浓度的提升，诱导作用明显加强，而各组CEM细胞凋亡情况也进一步证实了这一结论。本研究中，D组CEM细胞凋亡指数明显低于A、B、C组，而A组凋亡指数为明显高于其他三组。但本研究同时发现，添加1，25（OH）2D3浓度最高的A组的凋亡指数也仅为（41.23±4.10）%，细胞增殖抑制率仅为63.53%，提示单用1，25（OH）2D3的疗效较小，将1，25（OH）2D3与其他药物联合应用可能会提高疗效，但具体结果需做进一步的深入研究。

有研究表明[17]，1，25（OH）2D3对肿瘤的调节作用主要是通过VDR来实现的，其与VDR特异性结合后可促进VDR与视黄醛酸受体结合形成复合物，并与相应基因的启动子区域作用元件进行结合，进而抑制该基因的转录活性，而靶细胞对VD反应性的差异与VDR蛋白的表达水平相关。本研究同时发现，各组VDR mRNA表达差异并无统计学意义（P > 0.05），但A组VDR蛋白表达为0.612±0.042，明显高于其他三组，提示不同浓度的1，25（OH）2D3对VDR mRNA表达并无明显影响，但能调控VDR蛋白的表达，且随着浓度的升高，效果更为明显。

本研究选用人白血病6T-CEM细胞株作为研究对象，对比了不同浓度的1，25（OH）2D3对人白血病6T-CEM细胞株凋亡及VDR和蛋白表达的影响，证实了1，25（OH）2D3能抑制CEM细胞的增殖，诱导其凋亡，其作用机制可能与上调VDR蛋白的表达有关，这与文献的研究结果基本一致[18]。但也有研究表明[19-20]，1，25（OH）2D3诱导肿瘤细胞的凋亡与多种基因如C-myc、Bcl-2、TNF等的调控有关；本研究限于研究样本的不足，对于其作用机制仍需作进一步的深入研究。

综上所述，1，25（OH）2D3能有效抑制6T-CEM细胞增殖，诱导其凋亡，上调VDR蛋白表达。

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