蛇床子醇提物对大肠杆菌的抑制作用研究

赵锦慧，张 帆，郭 宁，张永亮，郭 婕

（周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口466001）

蛇床子醇提物对大肠杆菌的抑制作用研究

赵锦慧，张 帆，郭 宁，张永亮，郭 婕

（周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口466001）

以大肠杆菌为指示菌，OD值为测试指标，通过大肠杆菌菌体密度－吸光值曲线及回归方程的建立，获得大肠杆菌最佳菌悬液稀释度.利用滤纸片扩散法、倍比稀释法分别测定不同浓度的蛇床子醇提物对大肠杆菌的抑菌圈大小、最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）.结果显示：蛇床子醇提物对大肠杆菌的抑制作用明显，250mg／mL和500mg／mL下的抑菌圈直径分别为15.3mm和16.7mm，最低抑菌浓度（MIC）为250mg／mL，最小杀菌浓度（MBC）为500mg／mL.

蛇床子；醇提物；大肠杆菌；抑制作用

致病性大肠杆菌侵入人体一些部位时，可引起腹膜炎、膀胱炎、腹泻等.家畜家禽感染致病性大肠杆菌不仅会影响其生长和发育，严重时可导致其死亡，前人对此做了许多相关研究［1－6］.许多中药抑菌实验研究［7－13］表明，中药在现代预防和控制细菌性感染疾病方面发挥了积极作用.近年来，有关蛇床子单方或复方制剂对植物病原菌的抑制作用研究时有报道［14－16］，但关于蛇床子醇提物对致病性大肠杆菌的抑制作用研究鲜有报道，笔者对此进行研究，旨在为中草药蛇床子的开发利用提供一定的指导.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

大肠杆菌（Escherichia coil，ATCC11411），由周口师范学院生命科学与农学学院提供.

1.1.2 药材

蛇床子，购于周口同和堂大药店.

1.1.3 主要试剂

牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、1mol／L NaOH、1mol／L HCl、无水乙醇等.

1.1.4 主要试验仪器

JD200-3电子天平（沈阳龙腾电子有限公司），HZQ-F250A高低温恒温振荡培养箱（上海悦丰仪器仪表有限公司），THZ-82A气浴恒温振荡箱（江苏省金坛市医疗仪器厂），XSP-24N显微镜（江南显微镜仪器厂），HH-S型水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂），LDZX-40KBS立式电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），电子万用炉（天津市中环路实验电炉有限公司），DGF30电热鼓风干燥箱（南京实验仪器厂），XB-K-25血球计数板（上海安信光学仪器制造有限公司），7230G分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）.

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的制备

（1）牛肉膏蛋白胨固体培养基制备［17］

培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂10～20g、蒸馏水1 000mL.按培养基配方比例在电子天平上依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠放入烧杯中，在烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后在铺有石棉网的电炉上加热使其溶解，再将称好的琼脂放入已溶解的药品中，不断搅拌加热溶化，最后补充水分到所需的体积.冷却至常温后用1mol／L NaOH或1 mol／L HCl调节pH值至7.0～7.2.

（2）液体培养基制备

配制方法同固体培养基（不加琼脂）.

1.2.2 培养基及实验用品灭菌

将上述配制好的培养基分装在三角瓶中，将若干培养皿、试管、移液管、移液枪头等用报纸包好，置于高压蒸气灭菌锅内，121℃，0.1MPa下灭菌20min.

1.2.3 大肠杆菌生长曲线测定

（1）菌种的活化培养［18］

用无菌接种环从试管斜面中挑取少许大肠杆菌菌种，接种于液体培养基中，摇床扩大培养24h（37℃，130r／min）.

（2）菌液的稀释

用移液管吸取500μL已活化的菌悬液加入到装有4.5mL无菌水的试管中，混合均匀，制成10－1的稀释菌液，再从10－1的稀释菌液中吸取500 μL加入到装有4.5mL无菌水的试管中，制成10－2的稀释菌液，依次类推，分别制成10－3，10－4，…，10－9的稀释菌液.

（3）不同稀释度菌悬液的吸光值测定

用分光光度计测定上述不同稀释度菌悬液在波长为560nm处所对应的吸光值A.

（4）不同稀释度菌悬液对应的细菌个数测定用血球计数板计数，得出不同稀释度菌悬液对应的细菌个数（Xcfu／mL）.

（5）最佳菌悬液稀释度的确定

根据以上所测定的A，X数值，绘制大肠杆菌A－X曲线并得出相应的回归方程，根据A－X曲线及回归方程确定所需的最佳菌悬液稀释度（大肠杆菌的菌体密度控制在102cfu／mL）.

1.2.4 蛇床子醇提物的制备［19］

将蛇床子粉碎，过40目筛，称取粉末50g，加75%乙醇80℃下回流提取2次，每次2h，合并2次滤液，离心，取上清液，挥干溶剂后为醇提物.将醇提物用无水乙醇溶解，蒸馏水稀释至含生药500 mg／mL，乙醇终浓度为20%，调节pH为7.2，灭菌后4℃保存备用.

1.2.5 蛇床子醇提物对大肠杆菌生长的抑制作用指标测定

（1）滤纸片扩散法测抑菌圈［20－21］

将中草药蛇床子醇提物原液采用液体倍比稀释法进行稀释，用无菌水稀释后的药液浓度分别为250，125，62.5，31.25，15.625mg／mL.

将配好的牛肉膏蛋白胨培养基倒3个平板，作无菌检查.剪取直径约为6mm的滤纸片，灭菌后放在不同浓度的药液中浸泡约5h.在无菌工作台中，无菌平板先涂布0.2mL的大肠杆菌菌悬液（菌体密度为102cfu／mL），然后用灭过菌的镊子把浸泡过药液的滤纸片夹到平皿上，一个平皿放3片，最后把平皿放在37℃恒温箱中培养24h，观察是否有明显的抑菌圈，并测量其大小.

滤纸片扩散法可参考以下标准记录结果：抑菌圈＜10mm，表示不敏感；10mm表示轻度敏感；11～15mm，表示中度敏感；16～20mm，表示高度敏感.

（2）最低抑菌浓度（MIC）测定［22］

将中草药蛇床子醇提物原液采用液体倍比稀释法进行稀释，用营养肉汤培养基稀释后的药液浓度分别为250，125，62.5，31.25，15.625mg／mL.准备7个试管，编号标记，分别装入药液浓度为500，250，125，62.5，31.25，15.625，0mg／mL的药液培养基，每管均为10mL.用灭菌的移液枪头分别取1 mL具有合适菌体密度的菌悬液（菌体密度为102cfu／mL）加入到上述各试管中，混合均匀，将各试管放入摇床中培养（37℃，130r／min），24h后取出.在超净工作台上用无菌接种环将各管培养物取出，划线于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，平板置温度为37℃恒温箱中继续培养，24h后取出观察，以完全无菌生长的平板所对应的提取液的最低浓度作为中草药蛇床子醇提物的最低抑菌浓度（MIC）.

（3）最小杀菌浓度（MBC）测定［22］

在MIC测定的基础上，从未见细菌生长的各平皿所对应的试管培养物中各吸取0.1mL涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，37℃恒温条件下培养24h，观察结果，以仍无细菌生长的管内药物浓度记为该药的最小杀菌浓度（MBC）.设置3次重复.

2 结果与分析

2.1 菌悬液的合适菌体密度的确定

对一系列稀释度的大肠杆菌菌悬液在λ＝560 nm处测定其对应的吸光值A，同时用血球计数板计数，得出一系列稀释度的大肠杆菌菌悬液对应细菌个数（Xcfu／mL）.对所得吸光值A和对应的各稀释度的大肠杆菌菌悬液菌体密度X进行数据处理，绘出各稀释度的大肠杆菌菌悬液的A-X曲线，并得出相应的回归方程Y.见表1、表2、图1.

表1 大肠杆菌菌悬液稀释度与OD值的关系

图1 大肠杆菌菌体密度与OD值的关系图表2 大肠杆菌菌悬液稀释度与菌体密度的关系

通过检验所测各稀释度的大肠杆菌菌悬液A -X回归曲线、回归方程及A-X相关性显著.由此得出结论：大肠杆菌在波长λ＝560nm处吸光值为0.4（对应的菌悬液稀释倍数是10－8）时能保证菌体密度为102cfu／mL.

2.2 蛇床子醇提物对大肠杆菌生长的抑制作用

2.2.1 对大肠杆菌的抑菌圈测定结果

表3 蛇床子醇提物对大肠杆菌的抑菌圈直径

蛇床子醇提物对大肠杆菌的抑菌圈测定结果见表3.由表3可知，抑菌圈随着蛇床子醇提物浓度的升高而增大，蛇床子醇提物浓度小于62.5mg／mL时，大肠杆菌对其表现不敏感；蛇床子醇提物浓度等于62.5mg／mL时，大肠杆菌对其表现出轻度敏感；蛇床子醇提物浓度等于125mg／mL时，大肠杆菌对其表现出中度敏感；蛇床子醇提物浓度大于250mg／mL时，大肠杆菌对其表现出高度敏感.这说明合适浓度的蛇床子醇提物对大肠杆菌具有抑制作用，浓度越高，抑制作用越强.

2.2.2 对大肠杆菌的最低抑菌浓度测定结果

表4 蛇床子醇提物对大肠杆菌的最低抑菌浓度

蛇床子醇提物对大肠杆菌的最低抑菌浓度测定结果见表4.由表4可知，中草药蛇床子醇提物对大肠杆菌的抑菌程度随药液浓度的增大而增强，蛇床子醇提物浓度小于250mg／mL时，平板上仍有不同数量的大肠杆菌生长，蛇床子醇提物浓度≥250mg／mL时，平板上未见大肠杆菌生长，因此蛇床子醇提物对大肠杆菌的最低抑菌浓度为250 mg／mL.

2.2.3 对大肠杆菌的最小杀菌浓度测定结果

表5 蛇床子醇提物对大肠杆菌的最小杀菌浓度

蛇床子醇提物对大肠杆菌的最小杀菌浓度测定结果见表5.表5显示，在MIC测定的基础上重新涂布平板后，含有250mg／mL的蛇床子醇提物的平板上仍有少量的大肠杆菌生长，而500mg／mL的蛇床子醇提物的平板上未见到大肠杆菌，因此蛇床子醇提物对大肠杆菌的最小杀菌浓度为500mg／mL.

3 结论与讨论

3.1 结论

蛇床子醇提物对大肠杆菌有抑制作用，蛇床子醇提物浓度越高，对大肠杆菌的抑制程度越强，蛇床子醇提物浓度大于250mg／mL时，大肠杆菌对其表现出高度敏感.蛇床子醇提物对大肠杆菌的最低抑菌浓度为250mg／mL，最小杀菌浓度为500 mg／mL.

3.2 讨论

在制备蛇床子醇提物时，用的是75%的乙醇，设定温度为80℃，回流提取次数是2次，乙醇浓度、提取温度及提取次数可能会影响蛇床子有效成分的溶出量，提取方法不同（比如水提法）也会影响蛇床子有效成分的溶出量，所以该试验条件下得到的结果与前人［23］研究结果不一致.

由于较大的菌体密度会影响抑菌圈的产生，所以先要通过试验得到最佳菌体密度.笔者通过不同稀释度菌液吸光度的测定获得了合适菌体密度的菌悬液，提高了试验的准确性.

中药抑菌作用源自其有效成分或与其它药物的协同作用，其作用强弱受药物配伍的影响［24－25］.可进一步将蛇床子与其它中草药配伍，研究其对致病性大肠杆菌的抑制效果，为临床试验提供参考.

蛇床子醇提物中含有多种化学成分，究竟是哪些化学成分在抑制致病性大肠杆菌的过程中起到关键作用有待于进一步探讨.

［1］徐倩倩，郭时金，王艳萍，等.白头翁汤方及其单味药水提取液对猪、鸡大肠杆菌体外菌活性的测定［J］.黑龙江畜牧兽医，2016（6）：185－187.

［2］陈华维，杨树红，杨圣陶.中药组方对猪大肠杆菌病的抑菌及临床治疗试验［J］.兽医导刊，2016（2）：77－78.

［3］张燕，敖日格乐，王纯洁，等.nisin和EDTA对牛源致病性大肠杆菌体外抑菌效果的研究［J］.中国农业大学学报，2016（5）：98－103.

［4］王志伟.大板黄复方制剂对鸡大肠杆菌的体外抑菌试验［J］.河南畜牧兽医：综合版，2016，37（5）：6－8.

［5］韩杰，周子琳，许人骥.刺五加多糖对白痢仔猪粪便大肠杆菌的抑菌效果研究［J］.现代畜牧兽医，2016（5）：5－8.

［6］张雪梅，熊焕章，李晶，等.仔猪大肠杆菌的分离鉴定及中药抑菌试验［J］.中国兽医杂志，2006，42（1）：33－34.

［7］华鹃，周明康，周琼珍，等.五十种传统清热解毒药的抑菌实验［J］.中药材，1995（18）：255－258.

［8］蒋丹，王关林.几种中草药抑菌活性的研究［J］.辽宁高职学报，2003，5（4）：140－l41.

［9］陈长春，张新彩.秦岭11种丁香属植物抗菌作用的实验研究［J］.陕西林业科技，1995（3）：11－12.

［10］曾克强.几种植物提取物和天然产物对马铃薯晚疫病的抑制作用［J］.河北农业大学学报，2001，24（2）：90－96.

［11］王德海，程国富.10种中草药对大肠杆菌的体外抗菌试验［J］.动物医学进展，2005，26（6）：42－43.

［12］黄雪泉.八种中草药体外抑制大肠杆菌的效果观察［J］.贵州畜牧兽医，2009，33（1）：3－4.

［13］纪莉莲，范怡梅.土茯苓体外抗菌活性实验［J］.中国生化药物杂志，2002，23（5）：239.

［14］尹彩萍，张应烙，邓贤兰，等.蛇床子等中药提取物对几种病菌生物活性的初步研究［J］.井冈山学院学报（自然科学版），2005，26（1）：33－34.

［15］黄昌华，杨天武，肖风平，等.蛇床子素对植物病原菌抑制效果的测定［J］.华中农业大学学报，2005，24（3）：258－260.

［16］马丽娟，周宝利，张淑红，等.蛇床子提取物对黄瓜枯萎病菌抑制效果的研究［J］.植物保护，2008，34（4）：36－39.

［17］蔡信之.微生物学［M］.北京：高等教育出版社，2002：394－395.

［18］崔晓峰，黄永莲.茶籽浸提液抑菌作用研究［J］.岭南师范学院学报，2016，37（3）：98－102.

［19］赵锦慧，陈璨，刘中华，等.中草药凤尾草两种提取物的抑菌活性研究［J］.时珍国医国药，2013，24（5）：1110－1111.

［20］马井喜，沈明洁.不同采摘期长白山野生蒲公英提取液体外抑菌效果的比较［J］.黑龙江畜牧兽医，2016（5）：200－202.

［21］张晓文，张欠欠，王学军，等.通经草不同部位提取物体外抑菌作用研究［J］.陕西农业科学，2015，61（6）：4－5.

［22］李婷，杨舒然，陈敏，等.姜厚朴水提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌机理研究［J］.现代食品科技，2016（2）：84－92.

［23］王兴华，刘大芳，徐军，等.苦参蛇床子等六种药用植物的抑菌研究［J］.山西大学学报（自然科学版），1999，22（4）：383－386.

［24］魏振装.中草药抗感染作用机理探讨［J］.四川医药，1991，9（4）：17－18.

［25］王嵩.中草药抗细菌感染的研究［J］.北京中医杂志，2002，21（4）：249－251.

Study on inhibiting effect of alcohol extract from common cnidium fruit on Escherichia coli

ZHAO Jinhui，ZHANG Fan，GUO Ning，ZHANG Yongliang，GUO Jie
（College of Life Science and Agronomy，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466001，China）

Selecting Escherichia coli as indicator bacteria and adopting OD value as test indicators，through microbial density of Escherichia coli and absorbance curve and regression equation to obtain the best bacterial suspension dilution of Escherichia coli.Inhibiting effect of different concentrations of alcohol extract from common cnidium fruit on Escherichia coli was studied by utilizing filter paper diffusion method and doubling dilution，testing index included inhibition zone size，minimum inhibitory concentration（MIC）and minimum bactericidal concentration（MBC）.The results showed that alcohol extract from common cnidium fruit had obvious inhibiting effect on Escherichia coli，inhibition zone size was 15.3mm and 16.7mm respectively under 250mg／mL and 500mg／mL of alcohol extract from common cnidium fruit，minimum inhibitory concentration（MIC）was 250mg／mL and minimum bactericidal concentration（MBC）was 500mg／mL.

common cnidium fruit；alcohol extract；Escherichia coli；inhibiting effect

R282.71

A

1671-9476（2017）02-0102-04

10.13450／j.cnkij.zknu.2017.02.025

2016-07-18；

2016-11-25

国家自然科学基金项目（No.41271280）；河南省高等学校重点科研项目（No.16B360007）

赵锦慧（1979－），女，河南周口人，硕士，讲师，研究方向为生物技术及植物逆境生理.