香烟烟雾水溶液诱导大蒜根尖细胞产生微核

肖星辉，李予霞，徐 亮，王小奎，李文超，李佳馨，刘红玲,2

（1.石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832000；2.成都师范学院，四川 成都 611130）

香烟烟雾水溶液诱导大蒜根尖细胞产生微核

肖星辉1，李予霞1，徐 亮1，王小奎1，李文超1，李佳馨1，刘红玲1,2

（1.石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832000；2.成都师范学院，四川 成都 611130）

为了探究香烟烟雾水溶液对大蒜根尖细胞遗传物质的影响，通过常规的微核技术观察了香烟烟雾水溶液不同浓度和不同时间处理下根尖细胞中微核的形态和数量。结果表明：在0.5～8支/mL的浓度范围内，大蒜根尖细胞的微核率随着浓度的增加而不断上升，差异极显著（P＜0.01）；在12～36 h处理时间范围内，微核率随着处理时间的增长呈现先升高后降低的趋势；当处理时间为12和24 h时，微核率随着浓度的增加而明显上升，而当处理时间为36 h时，微核率随着浓度的增加呈现先升后降的趋势；香烟烟雾水溶液的浓度和处理时间与微核的产生显著正相关，烟雾浓度对大蒜根尖细胞微核产生的贡献更大；试验组的细胞微核率均极显著高于空白对照组（P＜0.01），微核指数均大于3.5，属于重度损伤。上述结果表明，香烟烟雾水溶液在较低的浓度（0.5支/mL）和较少的处理时间（12 h）就对植物遗传物质产生严重损伤。

香烟烟雾水溶液； 大蒜根尖；微核；浓度；处理时间

香烟燃烧产生的烟雾中含有5 000余种化学物质，这些化学物质既有植物烟草本身含有的，也有烟草燃烧后产生的[1]。由于燃烧不完全，香烟发生热裂解和热化合反应会产生大量的致突变物、致癌物和促癌物等有害物质。这些有害化学成分，进入机体后可严重干扰其正常生理功能，继而对生物体产生多方面的损害[2]。例如卷烟烟气水溶液对斑马鱼有毒性致死影响[3]；香烟烟气浸出物能够使糖尿病恶化[4]；而女性长期接触香烟烟雾，会使卵巢卵泡储存量下降、卵巢功能减弱，致使女性生育力下降，并提早进入更年期[5]。香烟烟雾也是引起肺癌的主要原因，目前吸烟已成为我国乃至全世界引起生物早亡和疾病的重要原因[6]。香烟烟雾危害人体健康已经成为公认的事实。因此，采取一定手段研究香烟烟雾水溶液对生物细胞微核遗传物质的影响，以更好地揭示其致病机理，是非常必要的。

微核（micronucleus，简称 MN）是指位于细胞浆中独立于主核之外的小核，形状为圆形或椭圆形，可以是整条染色体，也可以是染色体断片，染色略浅，直径小于主核的1/3[7-8]。细胞质中微核主要有两种来源：一种为诱变剂使DNA分子断裂成DNA片段，DNA片段不能随染色体分离被拉向两极，形成独立于细胞核之外的具有核形状的微核；另一种为纺锤丝造成的整条染色体落后于核分裂周期形成微核[9]。微核产生的数量与诱变因子浓度呈正比，外界诱变因子越强，细胞的损伤程度越严重，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质损伤的程度[10-12]。试验采用常规的微核技术[13]来观测香烟烟雾水溶液不同浓度和不同时间处理下大蒜根尖细胞中微核的形态和数量变化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大蒜（购自新疆石河子市金马市场）、香烟（焦油量0.6 mg，烟气一氧化碳量11 mg，甘肃烟草工业有限责任公司）。供试药品有盐酸、无水乙醇、冰醋酸、碱性品红、苯酚、山梨醇、甲醛等，均为分析纯。主要仪器有烘箱、光学显微镜等常规仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 大蒜生根 选取颗粒饱满、无损伤、大小一致的大蒜放入培养皿中，倒入蒸馏水使大蒜根部没入水中，置于25℃下培养48 h，待初生根长出1～2 cm，即可用来进行下一步处理。

1.2.2 香烟烟雾水溶液的配制 （1）香烟烟雾简易吸取器制作：挑选一个枪头，把枪头的细端紧密的结合到已经去除针头的50 mL注射器的注射口，用注射器针头在瓶盖上打一个小孔，恰好允许针头穿过瓶盖，再把与针头相配套的针皮管与针头相接，而皮管另一头浸入蒸馏水中。装置图和实物图如图1所示。（2）香烟烟雾水溶液的配制：把烟头插入枪头的大端，点燃香烟，迅速吸取烟雾，并快速注入到密封的瓶中，每根香烟固定用50 mL注射器吸取10次（经过预实验，一根烟大约10次可以完全吸尽），配成0.5支/100 mL、1支/100 mL、2支/100 mL、4支/100 mL、8支/ 100 mL 5个浓度梯度。

图1 香烟烟雾简易吸取器示意图和实物图

1.2.3 染毒处理 选取等量、长势一致的大蒜粒分别放入蒸馏水、0.5支/100 mL、1支/100 mL、2支/100 mL、4支/100 mL、8支/100 mL的烟雾水溶液中，分别于12、24、36 h取出大蒜粒，清洗表面的烟雾水溶液，放入清水中，置于25℃的恒温培养箱中恢复培养24 h。

1.2.4 染色制片 大蒜粒在恢复培养后从根尖顶端部位切下1 cm 左右的幼根；用卡诺氏液在Eppendorf 管中固定，24 h后进行酸解；用蒸馏水漂洗3～5 次，吸去多余水分，将根尖置于载玻片上，加适量改良石炭酸品红进行染色，染色10～15 min；在染色过程中，用镊子适当的夹碎根尖，盖上盖玻片，包裹吸水纸，然后用镊子敲打盖片，使细胞分散开，铺成薄薄一层。

1.2.5 镜 检 选取视野清晰、细胞分散均匀的装片进行显微观察，每张装片统计大约1 000个细胞，记录每张装片产生微核的细胞数。

1.3 数据统计与分析

利用Excel和IBM SPSS 23对镜检的数据进行统计分析。

2 结果及分析

2.1 香烟烟雾水溶液处理下大蒜根尖细胞产生微核的形态

显微观察发现，不同浓度的香烟烟雾水溶液处理会刺激大蒜根尖细胞产生各种形态的微核，如图2所示，有单微核、双微核和钩形微核；其中，以单微核出现的频率最高，且微核的大小不一。

2.2 香烟烟雾水溶液处理下大蒜根尖细胞产生微核的数量变化

由图3可知，随着香烟烟雾水溶液浓度的增加，大蒜根尖细胞产生的微核越多，微核率越高；而随着处理时间的延长，大蒜根尖细胞出现微核的几率呈现先上升后降低的趋势，以处理24 h时，微核率最高。

由表1可知，不同浓度和不同时间的香烟烟雾水溶液处理，大蒜根尖细胞的微核率差异均达极显著水平（P＜0.01）。从表2中可以看出，大蒜根尖细胞微核率随着浓度的增加而不断升高，不过，当浓度增大到4支/mL时，虽然微核率仍然随着浓度的增加而增加，但是其增长的幅度明显降低。

由表3可知，大蒜根尖细胞微核率随着染毒时间的不断延长而呈现先增加后降低的趋势。从图3中可以看出，当处理时间为12 和24 h时，微核率均以香烟烟雾水溶液浓度为8支/mL处理的最高，分别为96.2%和136.5%；而当处理时间为36 h时，微核率以2支/mL处理的最高，为93.8%；不同香烟烟雾处理的微核率均大于空白对照组，且微核指数均大于3.5，属于重度损伤。

另外，从表1中还可以看出，染毒时间和烟雾水溶液的浓度对微核率的影响是具有交互作用的，且交互效应极显著（P＜0.01），表明处理时间和烟雾水溶液浓度共同作用引发植物细胞微核的产生。

图2 香烟烟雾水溶液处理大蒜根尖细胞产生的微核形态

图3 香烟烟雾不同浓度和不同时间处理大蒜根尖细胞微核率的比较

表1 不同浓度和处理时间的主体间效应检验

表2 不同浓度对微核率的影响

表3 不同处理时间对微核率的影响

2.3 处理浓度和处理时间与大蒜根尖细胞微核率的相关性分析

采用IBM SPSS23软件对数据进行相关性分析，由表4可知，控制浓度对微核率和处理时间进行偏相关分析得出，相关系数r=0.084，P=0.432，因此可以得出处理时间与微核率相关性不显著。由表5可知，在控制处理时间对微核率和浓度进行偏相关分析时，相关系数r=0.816，P＜0.01，因此可以得出烟雾水溶液的浓度与微核率显著正相关。

表4 处理时间与微核率的相关性分析

对处理12和24 h的试验组数据进行分析可知（表6），控制浓度对微核率和处理时间进行偏相关分析得出，相关系数r=0.775，P＜0.01，因此可以得出处理时间与微核率呈现显著正相关关系；由表7可知，在控制处理时间对微核率和浓度进行偏相关分析时，相关系数r=0.972，P＜0.01，因此可以得出香烟烟雾水溶液浓度与微核率呈现显著正相关关系。由两者的相关性系数对比可知，烟雾水溶液浓度与微核率的相关性更高。

表6 处理时间与微核率的相关性分析（12和24 h试验组）

表7 浓度与微核率的相关性分析（12和24 h试验组）

3 结论与讨论

该研究显示，烟雾水溶液浓度越高，对大蒜根尖细胞遗传物质的损伤越严重，在一定处理时间范围内（24 h以内），处理时间越长，大蒜根尖细胞的产生的微核越多，遗传物质损伤也就越严重。但如果处理时间超过24 h，且香烟烟雾浓度≥2 支/100 mL时，微核率反而会随着浓度的增大而呈现下降的趋势。这可能是因为当处理时间过长，处理剂量达到一定浓度时，植物根尖细胞被杀死，导致统计到的细胞数目和微核变少，微核率随之降低。另外一种可能是处理时间过长，在高浓度的香烟烟雾水溶液处理下植物细胞通过一系列的生理调节对高浓度产生一定的适应性，从而使得烟雾水溶液对根尖细胞中染色体的表观损伤减小，微核率降低。仪慧兰等[14]在研究SO2对蚕豆根尖细胞微核的诱导作用时也认为蚕豆可以在短时间内适应环境中低浓度的SO2，并通过较长时间适应较高浓度的SO2，从而使得SO2对根尖细胞中染色体的表观损伤减小。另外，任子蓓等[15]认为高浓度处理将强烈抑制植物细胞有丝分裂，使分裂细胞显著减少，使处于间期的细胞容易发生畸变而不形成微核，从而间接导致细胞微核率降低。王五香等[16]的研究也表明，污染物的浓度较高，影响蚕豆根尖细胞分裂时其微核率反而降低。而王兰君等[17]通过研究4 种典型PPCPs对蚕豆和大蒜根尖细胞微核率的影响时指出，低浓度范围内随着处理剂浓度的增加，对根尖细胞染色体DNA的毒性随之增强，微核率呈增加趋势；随着浓度的进一步增大，微核率反而呈下降趋势；有可能是因为高浓度处理剂的毒性增强，使细胞的正常分裂活动受到减缓、抑制、甚至终止，导致高浓度胁迫下微核出现的频率降低。但这些都只是人们的猜测，确切的机理有待于进一步的研究。

另外，通过12、24 h试验组可以得出，烟雾水溶液浓度、处理时间都与微核率呈现显著的正相关关系，但烟雾水溶液浓度与微核率的相关性更高。这显示烟雾水溶液的浓度与微核的产生关系更加密切，烟雾水溶液浓度对微核产生的贡献更大。这可能是随着烟雾水溶液浓度的增加，溶液中损害植物遗传物质的颗粒也就越多，进入细胞的毒性物质随之增加，故对细胞染色体DNA的损伤也就越严重。

烟雾水溶液的浓度和处理时间对微核的产生有较强的交互效应（P＜0.01）。这可能与烟雾水溶液中有毒颗粒进入细胞的速度有关，在单位时间内，只有一定数量的有毒颗粒能够进入细胞，损害植物细胞遗传物质。在烟雾水溶液浓度一定的情况下，也只有经过一定的时间才能对植物细胞的遗传物质造成影响。

研究结果还显示，微核指数均大于3.5，属于重度损伤[18]。这表明香烟的烟雾水溶液确实能严重损害植物细胞的遗传物质。

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（责任编辑：成 平）

Influence of Water-soluble Fraction of Cigarette Smoke on the Micronucleus Root-Tip Cells of Garlic

XIAO Xing-hui1，LI Yu-xia1，XU Liang1，WANG Xiao-kui1，LI Wen-chao1，LI Jia-xin1，LIU Hong-ling1,2
（1. College of Biology Science, Shihezi University, Shihezi 832000, PRC; 2. Chengdu Normal University, Chengdou 611130, PRC）

In order to explore the infuence of the water-soluble fraction of cigarette smoke on the micronucleus of plant cells, choosing the garlic rooy tip as the experimental material and extracting water-soluble fraction of different concentrations, this study analyses the infuence of different concentration and treatment time on the genetic material of cells of root tip of Garlic. The results indicated that micronucleus rate increased with the concentration increases when the range of water-soluble fraction of cigarette smoke is 0.5 to 8. The rate of micronucleus increases frst and then decreases at last when treatment continued12-36 h. however, when the treatment continued 12 or 24 hours, the rate of micronucleus increases quickly with the growth of concentration. While the treatment continued 36 hour, the rate of micronucleus increases frst and then decreases at last. the concentration and treatment time have an interaction on producing micronucleus, and the concentration of water-soluble fraction of cigarette smoke contributes more to producing micronucleus than the treatment time. All the rate of micronucleus of experimental group exceeds that of control group (P＜0.05), and the index of micronucleus is bigger than 3.5, belonging to severe damage. In conclusions, under the quite low concentration (0.5/mL) and less treatment time , the water-soluble fraction of cigarette smoke has severe damage to the genetic material of plant.

water-soluble fraction of cigarette smoke; root tip of Garlic; micronucleus; concentration; treatment time

Q355; X171. 5

：A

：1006-060X（2017）06-0007-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.006.003

2017-03-25

石河子大学高层次人才启动项目（RCZX201546）；石河子大学3152人才项目（3152SFXY04027）；石河子大学教改项目（SJ-2015-13）

肖星辉（1995-），男，湖南新化县人，本科生，生物技术专业。

刘红玲