毛梾腋芽诱导关键因子研究与培养体系优化

张娜

(山西省林业科学研究院，山西 太原 030012)



毛梾腋芽诱导关键因子研究与培养体系优化

张娜

(山西省林业科学研究院，山西 太原 030012)

[目的]建立毛梾茎段外植体高效腋芽诱导体系。[方法]以毛梾幼嫩茎段作为外植体，对灭菌剂及灭菌时间、采集时期、基本培养基、植物生长调节剂、pH值等腋芽诱导的影响因素进行研究。[结果](1)采用0.1% HgCl2灭菌4～5 min是最佳灭菌剂和灭菌时间；(2)4～5月是外植体较为理想的采集时期；1～3月是最佳采集时期，采用当年生枝条水培后的幼嫩茎段；(3)MS培养基是茎段腋芽诱导的最佳基本培养基；(4)MS培养基添加0.5～1.0 mg·L-1BA、0.1 mg·L-1NAA与0.1 mg·L-1IBA时，腋芽诱导率最高，分别达85.5%和84.4%；(5)最佳pH值为5.8；(6)光照培养环境更有利于毛梾腋芽诱导及生长。[结论]水培后的幼嫩茎段外植体经0.1% HgCl2灭菌4～5 min后，培养在MS添加0.5～1.0 mg·L-1BA、0.1 mg·L-1NAA与0.1 mg·L-1IBA，是毛梾腋芽诱导的最佳培养体系。

毛梾； 茎段外植体； 腋芽诱导

毛梾(CornuswalteriWanger.)，又名黑椋子、车梁木等，隶属山茱萸科梾木属落叶乔木[1]，集中分布在山西、河南、山东、陕西、河北等省份[2]。毛梾的果皮和种仁均含有丰富油脂，其中毛梾果实含油率可达31.8%～41.3%，果皮含油率达24.9%～25.7%[3]，是极具发展前景的食用和工业用油料树种。

目前，毛梾主要通过种子进行繁殖，但由于其果皮富含油脂，内果皮坚硬骨质，透水透气性差，种子繁殖困难。康永祥等采用低温层积方法对毛梾种子进行催芽，发芽率仅46.7%[4]；采用GA3处理，发芽率最高也仅48.43%[5]。也有部分学者对毛梾进行扦插和嫁接研究，但成活率都较低[6～8]。组织培养成为大规模、快速繁殖毛梾优良品种的必然选择。然而国内外对毛梾组织培养方面的研究尚处于初期阶段。仅有张丹等对毛梾初代培养影响因素进行研究[9，10]。因此，开展毛梾组织培养快速繁殖研究具有重要意义。

本研究通过对毛梾茎段腋芽诱导的影响因素进行系统研究，旨在建立毛梾茎段外植体高效腋芽诱导体系，为开展毛梾离体培养快速繁殖体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料的准备

采自侯马市绿博中条山植物繁育中心栽培的4～5年生、发育良好的毛梾幼嫩茎段作为本试验材料。

首先将毛梾幼嫩茎段去叶，肥皂水浸泡30 min，流水冲洗1 h。然后在超净工作台上先采用75%的酒精灭菌20～30 s，无菌水冲洗3次；再用灭菌剂进行灭菌处理后，无菌水冲洗5～6次，切成1.5 cm左右的带节茎段，准备接种。

1.2 试验设计和培养条件

1.2.1 灭菌剂及灭菌时间

本试验采用2%次氯酸钠溶液(NaClO)和0.1%氯化汞溶液(HgCl2)作为灭菌剂，分别设计不同灭菌时间梯度，具体为2% NaClO溶液(5、8、10、12 min)、0.1% HgCl2溶液(3、4、5、6 min)。培养4周后，观察统计毛梾茎段外植体的污染率和成活率。

1.2.2 外植体采集时期

本试验从2015年4-9月，每月中旬选择晴朗天气采集毛梾幼嫩茎段作为外植体；2015年10月-2016年3月每月中旬选择晴朗天气采集当年生枝条进行水培后，采用幼嫩茎段作为外植体进行灭菌接种。培养4周后，观察统计毛梾茎段外植体的污染率和成活率。

1.2.3 基本培养基

本试验采用MS、B5和WPM 3种培养基作为基本培养基。培养4周后，统计毛梾腋芽诱导率。

1.2.4 植物生长调节剂组合

本试验设计不同植物生长调节剂组合，分别为：不同浓度的BA(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)与0.1 mg·L-1NAA组合、不同浓度的BA(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)与0.1 mg·L-1NAA和0.1 mg·L-1IBA组合。培养4周后，统计毛梾腋芽诱导率。

1.2.5 pH值

本试验设计3种不同的pH值，分别为：5.4、5.8、6.2。培养4周后，统计毛梾腋芽诱导率。

1.2.6 光照环境

分别进行光照培养和黑暗培养，4周后，统计毛梾腋芽诱导率。

所有试验均采用单因素完全随机设计。每处理20瓶，重复3次。培养温度为(25±2) ℃；除光照环境试验的黑暗培养外，其余光照强度均为2 500～3 000 lx，光照时间14～16 h·d-1；除pH值试验外，其余培养基pH值均调整至5.8；所有培养基均添加蔗糖30 g·L-1、琼脂6.5 g·L-1。

1.3 数据统计与分析

试验数据均采用SPSS 17.0数据软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 灭菌剂及灭菌时间对毛梾茎段外植体灭菌效果的影响

由表1可见，不同灭菌剂及灭菌时间对毛梾茎段外植体的污染率和成活率均影响显著(P<0.05)。

表1 不同灭菌剂及灭菌时间对外植体灭菌效果的影响

Table 1 Effect of different disinfectants and treatment time on explants disinfection

灭菌剂类型Typeofdisinfectants灭菌时间/minTreatmenttime污染率/%Pollutionrate成活率/%Survivalrate2%NaClO01%HgCl25946±18a54±29d8878±20b122±20d10756±24c244±26c12623±38d269±70c3833±17bc167±21cd4346±19e654±19a5268±27e701±08a6211±26e422±45b

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同

Note: different lowercase letters show significant difference at the 0.05 level in the same column. Same below

研究结果表明，采用2% NaClO作为灭菌剂，灭菌时间为10 min时，污染率和成活率分别为75.6%和24.4%；随着灭菌时间的延长，污染率有所降低，但部分外植体出现褐化死亡现象，成活率仅为26.9%。采用0.1% HgCl2作为灭菌剂，当灭菌时间为4 min和5 min时，成活率均较高，分别达65.4%和70.1%；进一步延长至6 min时，污染率达最低，为21.1%，但部分外植体褐化死亡，成活率仅为42.2%。

由此可见，2% NaClO不适宜作为毛梾茎段外植体的灭菌剂，采用0.1% HgCl2灭菌4～5 min，是毛梾茎段外植体的最佳灭菌剂和灭菌时间。

2.2 采集时期对毛梾茎段外植体灭菌效果的影响

由表2可见，不同采集时期对毛梾茎段外植体污染率和成活率均有显著影响(P<0.05)。

表2 不同采集时期对外植体菌效果的影响

Table 2 Effect of different collection period on explants disinfection

采集时期Collectionperiod污染率/%Pollutionrate成活率/%Survivalrate4月278±16g704±19b5月286±27fg691±22b6月436±22de532±27de7月677±33b296±39g8月824±21a154±23h9月505±31cd448±22ef10月533±09c417±19f11月368±24ef605±26cd12月309±29fg641±23bc1月188±19h792±34a2月186±30h801±39a3月158±25h819±17a

研究结果表明，4-9月采集毛梾幼嫩茎段作为外植体时，4-5月的污染率较低，成活率较高，分别为70.4%和69.1%；6-9月，污染率呈先升高后降低的趋势。

10月到次年3月水培的幼嫩茎段作为外植体时，10月的污染率仍较高，成活率较低；11月、12月污染率逐渐降低，成活率逐渐升高；1-3月采集时，污染率最低，成活率最高，分别为79.2%、80.1%和81.9%。

由此可见，4-5月是毛梾茎段外植体较为理想的采集时期；1-3月采集当年生枝条进行水培后，采用幼嫩茎段作为外植体是毛梾茎段外植体的最佳采集时期。

2.3 基本培养基对毛梾茎段腋芽诱导的影响

由表3可见，基本培养基对毛梾茎段腋芽诱导率影响显著(P<0.05)。

表3 基本培养基对腋芽诱导的影响

Table 3 Effect of basal medium on induction of axillary bud

基本培养基Basalmedium腋芽诱导率/%Inductionfrequency腋芽萌发期/dGerminationstage生长表现GrowthsituationMS872±27a7～8良好，叶片伸展较快B5809±14ab8～10细弱，叶片伸展较快WPM770±13b8～10良好，叶片伸展较慢

研究结果表明，MS培养基培养的腋芽诱导率最高，达87.2%，腋芽在7～8 d开始萌发，植株生长健壮，叶片伸展较快。B5和WPM培养基培养的腋芽诱导率略低，腋芽萌发略晚，长势均不及MS培养基生长健壮。

由此可见，MS培养基是毛梾茎段腋芽诱导的最佳基本培养基。

2.4 植物生长调节剂组合对毛梾茎段腋芽诱导的影响

由表4可见，不同植物生长调节剂组合对毛梾茎段腋芽诱导率有极显著影响(P<0.05)。

表4 植物生长调节剂组合对腋芽诱导的影响

Table 4 Effect of plant growth regulator combination on induction of axillary bud

BA/mg·L-1NAA/mg·L-1IBA/mg·L-1腋芽诱导率/%Inductionfrequency05010667±17d10010742±23bc20010712±13cd050101855±12a100101844±13a200101789±06b

研究结果表明，当培养基添加不同浓度的BA与0.1 mg·L-1NAA组合时，腋芽诱导率低于BA、NAA与IBA组合。BA与NAA组合时，当BA浓度为1.0 mg·L-1，腋芽诱导率最高，达74.2%；高于或低于此浓度，腋芽诱导率均降低。BA、NAA与IBA组合时，当BA浓度为0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1时，腋芽诱导率最高，分别为85.5%和84.4%；当BA浓度提高至2.0 mg·L-1，腋芽诱导率有所降低，并伴有轻微玻璃化现象。

由此可见，培养基添加0.5～1.0 mg·L-1BA、0.1 mg·L-1NAA与0.1 mg·L-1IBA是毛梾茎段腋芽诱导的最佳培养基。

2.5 pH值对毛梾茎段腋芽诱导的影响

由表5可见，不同pH值对毛梾茎段腋芽诱导率影响极显著(P<0.05)。

表5 pH值对腋芽诱导的影响

研究结果表明，当pH值为5.8时，腋芽诱导率最高，达84.9%，腋芽在培养7～8 d时开始萌发，植株健壮，生长较快；当pH值升高至6.2时，腋芽诱导率有所降低，萌发较晚，生长也较慢，并伴有黄化苗。

由此可见，毛梾茎段腋芽诱导的最佳pH值为5.8。

2.6 光照环境对毛梾茎段腋芽诱导的影响

由表6可见，不同光照环境对毛梾茎段腋芽诱导率影响显著(P<0.05)。

表6 光照环境对腋芽诱导的影响

Table 6 Effect of light condition on induction of axillary bud

光照环境Lightcondition腋芽诱导率/%Inductionfrequency腋芽萌发期/dGerminationstage生长表现Growthsituation光照培养851±157～8植株健壮，叶片大而绿黑暗培养788±1710～12茎段细弱，叶片变小

研究结果表明，在光照培养环境下，腋芽诱导率最高，达85.1%，在培养7～8 d腋芽开始萌发，植株生长健壮，叶片大而绿；在黑暗培养条件下，腋芽诱导率略低，萌发较晚，茎段细弱，叶片变小，淡绿色，并伴有白化或黄化苗。由此可见，光照培养环境更有利于毛梾茎段腋芽诱导及生长。

3 结论与讨论

有效控制外植体污染是建立植物组织培养体系的重要前提。因外植体材料不同，需选用适宜的灭菌剂。本研究选用2% NaClO溶液和0.1% HgCl2溶液作为灭菌剂，并分别设计了不同灭菌时间进行试验。结果表明，采用0.1% HgCl2灭菌4～5 min是毛梾茎段外植体的最佳灭菌剂和灭菌时间。在红瑞木的组织培养试验中，也采用0.1% HgCl2作为灭菌剂，灭菌时间为8 min[11]。总的来说，毛梾茎段外植体灭菌较为困难，可能是由于自身覆盖有一层绒毛，容易滋生细菌，且不易消除[9]。

不同植物材料的最佳采集时期也不同。本研究结果表明，4-5月是毛梾茎段外植体较为理想的采集时期；1-3月采集当年生枝条进行水培后，采用幼嫩茎段作为外植体是毛梾茎段外植体的最佳采集时期。可能是由于4-5月是毛梾自然萌发、生长的季节，外植体比较幼嫩，携带病菌较少，容易消毒；1-3月正处于寒冷的冬季，外界环境中的病菌较少，而且水培后很快进行灭菌接种，外植体携带病菌也较少，因此也易于灭菌。但也有学者对苹果茎段进行组织培养研究发现，在3-6月采集的成活率可达60%，而7-11月采集则下降到10%，12月至翌年2月则在10%以下[12]。可见，不同植物材料须选择适宜的采集时期进行接种培养。

选择适宜的基本培养基是植物组织培养成功的关键问题之一。根据不同的植物材料选用合适的基本培养基。本研究发现，MS培养基是毛梾茎段腋芽诱导的最佳基本培养基，腋芽诱导率高于B5和WPM培养基。该研究结果与大多数成功的木本植物组织培养选用MS培养基结论一致。

木本植物组织培养中，外植体的诱导与植物生长调节剂的种类、组合及浓度有关[13]。本研究发现，培养基添加0.5～1.0 mg·L-1BA、0.1 mg·L-1NAA与0.1 mg·L-1IBA是毛梾茎段腋芽诱导的最佳培养基。在金叶红瑞木的离体快繁试验中发现，MS培养基添加0.5 mg·L-1BA与0.05～0.20 mg·L-1IBA是金叶红瑞木的最佳启动培养基[13]。毛梾和金叶红瑞木同属于山茱萸科梾木属植物，腋芽诱导所需的植物生长调节剂种类和组合却不尽相同。可见，不同植物材料需要根据自身的生长特性选择适宜的植物生长调节剂。

培养基的pH值因培养材料不同而异。大多数木本植物要求pH值在5.0～6.0[14]。本研究发现，毛梾茎段腋芽诱导的最佳pH值为5.8。陈陆琴等在彩萼石楠的组培快繁试验中发现，适宜外植体生长的最佳pH是5.4～5.8[15]。

通常情况下，芽的诱导都是在光照条件下完成的。在培养过程中发现，光照环境对毛梾腋芽诱导影响显著。光照环境下，植株生长健壮，叶片大而绿；黑暗环境下，茎段细弱，叶片变小，淡绿色，并伴有白化或黄化苗。可能是因为毛梾是喜阳植物，光照环境更有利于其生长。

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(编辑：马荣博)

The study of the key factors affecting axillary bud induction and optimizing system ofcornuswalteri

Zhang Na

(ShanxiAcademyofForestrySciences,Taiyuan030012，China)

[Objective]To establish an efficient system for axillary bud induction using young stem segments as explants ofCornuswalteri.[Methods]The paper studied the influence factors which included the disinfectant types and the disinfection time, the collection period of explants, the types of basic culture medium, the combination of plant growth regulators, pH et al.[Result](1) The best disinfectant and disinfecting time was 0.1% mercuric chloride for 4～5 min; (2) The better collection period for explants was from April to May; The best collection period was from January to March, using young stem segments as explants after water culture; (3) The optimum medium was MS medium for axillary bud induction; (4) The frequency of axillary bud induction were the highest when the medium supplemented with 0.5～1.0 mg·L-1BA and 0.1 mg·L-1NAA and 0.1 mg·L-1IBA with 85.5% and 84.4%; (5) The optimum pH was 5.8 for axillary bud induction; (6) Light culture was more beneficial for the induction and development of axillary bud.[Conclusion]Using young stem segments as explants after water culture, 0.1% mercuric chloride as disinfectant for 4～5 min, cultured on MS supplemented with 0.5～1.0 mg·L-1BA and 0.1 mg·L-1NAA and 0.1 mg·L-1IBA, were the best culture system for axillary bud induction ofCornuswalteri.

Cornuswalteri, Stem segment explant, Axillary bud induction

2017-04-04

2017-05-09

张娜(1985-)，女(汉)，山西新绛人，工程师，博士，研究方向：森林培育及林木组织培养快速繁殖

山西省科技攻关项目(20140311015-1)；山西省林业科技创新项目(2016)

S722.8

A

1671-8151(2017)09-0635-05