参草通脉颗粒对慢性心衰大鼠MMP—3与TIMP—3的影响的实验研究

张宇

[摘要] 目的 探讨参草通脉颗粒对慢性心衰大鼠MMP-3与TIMP-3的影响。方法 随机选取10只大鼠作为正常对照组，10只作为假手术组，40只构建慢性心衰模型，建模成功后随即选取30只，分为模型组、西药组及中药组，各10只；对照组、假手术组及模型组采用蒸馏水灌胃，西药组给予赖诺普利处理，中药组给予参草通脉颗粒处理；Western blot法检测心肌组织中MMP-3、TIMP-3蛋白表達量。结果 与正常对照组相比，假手术组MMP-3表达有所增加，TIMP-3表达有所下降，但组间比较差异不显著（P>0.05）；与假手术组相比，模型组MMP-3表达显著增加，TIMP-3表达显著下降（P<0.05）；中药组及西药组与模型组相比，MMP-3表达显著下调且TIMP-3表达显著上调（P<0.05），但并未恢复到假手术组水平；中药组与西药组组间比较MMP-3及TIMP-3表达差异不显著（P>0.05）。此外，中药组、西药组与模型组相比，LVIDs、LVIDd下降，EF 值上升（P<0.05）。结论 参草通脉颗粒可以下调MMP-3的表达，增加TIMP-3的表达，从而阻止MMP-3对心肌细胞外基质结构的破坏作用，阻止CHF的发展。

[关键词]参草通脉颗粒；心力衰竭；MMP-3；TIMP-3

[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）11-33-04

Experimental study on effects of Shencao Tongmai granule on MMP-3 and TIMP-3 in chronic heart failure rats

ZHANG Yu

Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Liaoning 110032， China

[Abstract] Objective To explore the effects of Shencao Tongmai granule on MMP-3 and TIMP3 expressions in chronic heart failure rats. Methods 10 rats were randomly selected as control group， other 10 as sham-operated group， and 40 rats were chosen underwent chronic heart failure model building， within which 30 were chosen as model group（10 cases）， western medicine group（10 cases）， and traditional Chinese medicine group（10 cases）， randomly. The control group， sham-operated group and model group were given gastric perfusion of distilled water. Western medicine group was taken lisinopril and the traditional Chinese medicine group was taken Shencao Tongmai granule. The expressing quantities of MMP-3 and TIMP3 in myocardial tissue were detected by Western blot. Results Compared with control group， the expression of MMP-3 in sham-operated group was increased and TIMP-3 decreased（P>0.05）. Compared with sham-operated group， the expression of MMP-3 in model group was increased and TIMP-3 decreased（P<0.05）. Compared with western medicine group and traditional Chinese medicine group， the expression of MMP-3 was decreased and TIMP-3 increased（P<0.05）. There was no significant difference of MMP-3 and TIMP-3 between western medicine group and traditional Chinese medicine group（P>0.05）. In addition， compared with model group， LVIDs and LVIDd decreased and EF values increasedin the traditional Chinese medicine group and western medicine group（P<0.05）. Conclusion Shencao Tongmai granule can reduce the expression of MMP-3 and promote the expression of TIMP-3， so as to stop the destruction of MMP-3 to myocardial extracellular matrix and to impede the progress of CHF.

[Key words] Shencao Tongmai granule； Cardiac failure； MMP-3； TIMP-3

慢性心力衰竭是指心脏的泵血功能不足，导致各组织灌注不足从而发生肺循环或（和）体循环淤血，是临床各种心脏疾病的最终发展[1-2]。细胞外基质（extracellular matrix，EMC）的正常合成与降解是心脏維持正常生理功能的基础；有研究表明，EMC的重构在慢性心力衰竭疾病的发生发展过程中起重要作用，而EMC的重构是体内基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）及其组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs）动态平衡的结果[3-4]。参草通脉颗粒是我院自行研制的中药制剂，临床用于治疗慢性心力衰竭且取得较好疗效[5]。基于此等理论基础，本研究探讨了经参草通脉颗粒处理后，慢性心力衰竭大鼠心肌基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）和基质金属蛋白酶特异性抑制物-3（tissue inhibitor of metalloproteinase-3，TIMP-3）表达的变化，旨在了解该病的致病机理并未该病治疗提供新的作用靶位点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验用12周龄SD大鼠购自辽宁长生生物技术有限公司[动物许可证号：SCXK（辽）2010-0001]，60只，体重为（230±10）g，雄性。将纳入的60只SD普通级12周龄雄性大鼠，经过一周适应性喂养，体重达到260～300g。随机选取10只作为空白对照组，正常饲养即可。另取10只作为假手术组，仅缝线于左冠状动脉前降支起源点2～4mm处穿针，但并不结扎。其余40只大鼠进行慢性心衰造模。在造模成功的心衰大鼠中随机选取30只作为研究对象并随机分为模型组、西药组和中药组，每组10只。

1.2 实验仪器

HD-1小动物呼吸机购自浙江医科大学医疗仪器实验厂，DYY-7C电泳仪购自北京六一公司，DYCZ-40D转移槽购自北京六一公司，SW1022-ProfiBlot 48全自动蛋白印迹分析仪购自美国Bioneer公司，DYCZ-24DN双垂直蛋白电泳仪购自北京六一公司，MicroChemi 4.2凝胶电泳成像分析系统购自以色列DNR公司，DYY 40B 型转印电泳槽购自北京六一仪器厂。

1.3 实验药品与试剂

参草通脉颗粒配方中包含人参、丹参、黄芪、葶苈子、益母草、红花、茯苓等，由辽宁中医药大学附属医院制备并负责煎煮，汤剂浓缩至相对密度1.06～1.07的液体。赖诺普利片（上海信谊万象药业股份提供，H10960265，规格：10m/片）。组织总蛋白提取试剂盒、MMP-3、TIMP-3及β-actin单克隆抗体及二抗均购自美国sigma公司。

1.4 动物分组及处理

慢性心衰造模，具体步骤为：采用0.4mL/100g 10%水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司，H37022673）腹腔麻醉，之后背位固定；人工呼吸经喉气管插管术连接小动物呼吸机进行，参数为频率80～100次/min，潮气量6.0mL/kg，呼吸比例1∶2，剪胸部毛，四肢及胸壁皮处刺入针形电极用于连接心电图机，记录心电图。常规消毒后在左侧第三、四肋间横向切开皮肤1.5cm，分离出胸骨及肋软骨，沿3、4肋间隙打开胸腔，处理心包膜后使心脏暴露，选择在左冠状动脉前降支起源点2～4mm处对左冠状动脉主干进行结扎，当胸前导联ST段及T波出现异常时将心脏放回胸腔，迅速缝合。使用青霉素钠[石药集团中诺药业（石家庄）有限公司，H13021984]对伤口进行处理，在大鼠状态平稳后停人工呼吸。对大鼠口腔内痰进行清理；为防止感染，进行5d的青霉素钠4万单位/（次·日）注射。之后一周进行常规喂养，在第二周饲料减半，使大鼠处于饥饿状态，同时每天游泳一次至其疲乏，经四周处理后对。左室射血分数采用多普勒超声心动图进行检测，当心脏射血分数（ejection fraction，EF值）≤55%或心脏指数（cardiac index，CI值）≤180mL/（min·kg）者为心衰[6-7]，同时大鼠表现为毛色无光泽，精神萎靡。

空白对照组、假手术组及模型组大鼠均采用常规等容积蒸馏水灌胃，不进行药物处理；西药组给予1.5mg生药/（kg·d）赖诺普利（丽珠集团丽珠制药厂，H64200082）处理，中药组给予9.2g生药/（kg·d）参草通脉颗粒处理。

1.5 MMP-3和TIMP-3表达量检测

各组（空白对照组，假手术组，模型组，中药组，西药组）实验大鼠经灌胃给药处理4周后，采用多普勒超声心动图进行左室收缩末期内径（LVID）、左室舒张末期内径（LVIDd）以及左室射血分数（EF%）的检测。

随后，禁食不禁水12h。全部进行麻醉处死。取100mg左右心肌组织进行总蛋白提取并对提取浓度进行测定，样品-80℃保存。以β-actin作为内参，MMP-3和TIMP-3表达量采用Western blog进行测定；所有蛋白样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离后转印至PVDF 膜上，分别用MMP-3、TIMP-3及β-actin一抗进行孵育，之后使用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，曝光及洗片使用仪器进行定量分析。

1.6 统计学分析

数据使用excel进行整理，统计分析采用SPSS20.0软件，计量资料均采用（）表示，采用单因素方差分析（one-way AONVA）进行比较，组间比较采用t检验，具有统计学差异的评判标准为P<0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠MMP-3及TIMP-3表达量比较结果