山梨猕猴桃根化学成分及细胞毒活性研究

黄初升　马思远　刘红星　陆倩　石灵高　廖娜　韦柳斌

[摘要]探究山梨猕猴桃Actinidia rufa根的化学成分。采用葡聚糖凝胶色谱法、薄层色谱硅胶色谱法、高效液相色谱法等方法分离得到9个化合物，鉴定为：2α， 3β， 19α， 23， 24五羟基乌苏12烯28OβD吡喃葡萄糖苷（1）、2α， 3α， 19α， 24四羟基乌苏12烯28OβD吡喃葡萄糖苷（2）、2α， 3α， 24三羟基乌苏12烯28酸（3）、2α， 3α， 24三羟基齐墩果12烯28酸（4）、2α， 3α， 23， 24四羟基乌苏12烯28酸（5）、2α， 3β， 23， 24四羟基乌苏12烯28酸（6）、2α， 3β， 23三羟基乌苏12烯28酸（7）、2α， 3β， 23三羟基乌苏12， 20（30）二烯28酸（8）、2α， 3α， 24三羟基乌苏12， 20（30）二烯28酸（9），其中化合物1和2为首次从该属植物中分离得到。细胞毒活性测试结果显示化合物2～4 对人卵巢癌细胞株SKVO3和人甲状腺乳头状癌细胞株TPC1具有强的细胞毒活性（IC50在1099～1641 μmol·L-1），而化合物3，4对人宫颈癌细胞株HeLa具有强的细胞毒活性，IC50分别为1553，1307 μmol·L-1。

[关键词]猕猴桃属； 山梨猕猴桃； 三萜； 抗肿瘤

[Abstract]To investigate the chemical compounds from the roots of Actinidia rufa， nine compounds were isolated by various column chromatography on silica gel and Sephadex LH20， and high performance liquid chromatography （HPLC） Their structures were elucidated as 2α， 3β， 19α， 23， 24pentahydroxyurs12en28oic acid28OβDglucopyranoside （1）， 2α， 3α， 19α， 24tetrahydroxyurs12en28oic acid28OβDglucopyranoside （2）， 2α， 3α， 24trihydroxyurs12en28oic acid （3）， 2α， 3α， 24trihydroxyolean12en28oic acid （4）， 2α， 3α， 23， 24tetrahydroxyurs 12en28oic acid （5）， 2α， 3β， 23， 24tetrahydroxyurs12en28oic acid （6）， 2α， 3β， 23trihydroxy12en28oic acid （7）， 2α， 3β， 23trihydroxyurs12， 20（30）dien28oic acid （8）， and 2α， 3α， 23trihydroxyurs12， 20（30）dien28oic acid （9） Compounds 1 and 2 were isolated from the Actinidia genus for the first time Compounds 2， 3， and 4 showed cytotoxic activity against human SKVO3 and TPC1 cancer cell lines with IC50 values ranging from 1099 to 1641 μmol·L-1， compounds 3 and 4 have cytotoxic activity against human HeLa cancer cell line with IC50 values of 1553 and 1307 μmol·L-1， respectively

[Key words]Actinidia； Actinidia rufa； triterpenoids； antitumor

山梨獼猴桃Actinidia rufa Planch为猕猴桃科猕猴桃属植物，药用其根或根皮[1]，产于广西山区龙胜、德保等县。猕猴桃属植物自古以来就有药用作用，古代药书《山海经·中山经》、《本草拾遗》、《本草纲目》等均有记载[1]；中医认为其果性寒，味酸、甘，能调理中气、生津润燥、解热除烦、通淋，用于治疗消化不良、食欲不振、呕吐、烧烫伤；其根或根皮性寒、味苦涩，能清热解毒、活血消肿、祛风利湿，用于治疗肝炎、水肿、风湿性关节炎、跌打损伤、痢疾、丝虫病、淋巴结核、痈疖肿毒、带下、胃癌、乳腺癌等[2]。迄今，该属植物研究较多的主要是美味猕猴桃和中华猕猴桃，研究部位集中于果实和根部。

本课题组对山梨猕猴桃根进行了化学成分研究，分离得到7个五环三萜类化合物和2个乌苏烷型三萜皂苷，分别鉴定为：2α，3β，19α，23，24五羟基乌苏12烯28OβD吡喃葡萄糖苷（1）、2α，3α，19α，24四羟基乌苏12烯28OβD吡喃葡萄糖苷（2）、2α，3α，24三羟基乌苏12烯28酸（3）、2α，3α，24三羟基齐墩果12烯28酸（4）、2α，3α，23，24四羟基乌苏12烯28酸（5）、2α，3β，23，24四羟基乌苏12烯28酸（6）、2α，3β，23三羟基乌苏12烯28酸（7）、2α，3β，23三羟基乌苏12，20（30）二烯28酸（8）、2α，3α，24三羟基乌苏12，20（30）二烯28酸（9），其中化合物1和2为首次从该属植物中分离得到。细胞毒活性测试结果显示化合物2～4 对人卵巢癌细胞株SKVO3和人甲状腺乳头状癌细胞株TPC1具有较强的细胞毒活性[IC50在1099～1641 μmol·L-1]，而化合物3和4对人宫颈癌细胞株HeLa具有较强的细胞毒活性，IC50分别为1553，1307 μmol·L-1。

1材料

Bruker 300超导型核磁共振波谱仪（德国布鲁克公司，TMS内标）；红外光谱仪（赛默飞世尔公司Nicolet 6700型）；质谱仪（Finnigan LCQ advatage MAX）；分析型高效液相（北京北方威玛龙公司，检测器UC329）；制备型高效液相（大连依利特，P230P型，检测器DAD230+）；C18分析型色谱柱（46 mm×250 mm，5μm，月旭公司）；C18制备型色谱柱（

212 mm×250 mm，5 μm，月旭公司）；Sephadex LH20葡聚糖凝胶（美国GE公司）；薄层色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX50FB 型，上海申安医疗器械厂）；电热恒温鼓风干燥箱（DHQ9070A型，上海精密实验设备有限公司）；电热恒温水箱（DKB8A 型，上海精密实验设备有限公司）；CO2培养箱（MCO5AC 型，日本SANYO Electric COLtd）；倒置显微镜（CKX41 型，日本Olympus公司）；台式低速冷冻离心机（L535R 型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；酶标仪（Multiskan MK3型，上海赛默飞世尔仪器有限公司）；超净台（VFB1500型，上海毅昕实验室设备有限公司）；胎牛血清（FBS）（美国 Gibco 公司）；青霉素链霉素溶液（碧云天生物研究所）；胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）；RPMI1640培养基（上海立菲生物技术有限公司）；四氮噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司）；7种人肿瘤细胞株：口腔表皮样癌Kb、宫颈癌HeLa、胃癌SGC7901、鼻咽癌CNE2、肺癌A549、卵巢癌SKVO3、甲状腺乳头状癌TPC1（由江阴康众康民生物医药技术公司和广西医科大学提供）；山梨猕猴桃根于2002年6月在广西植物研究所苗圃采集，由中国科学院广西植物研究所李瑞高和梁木源研究员鉴定，标本存于中国科学院广西植物研究所，标本号为020617。

2提取与分离

山梨猕猴桃根用95%乙醇常温提取3次，提取液减压回收溶剂得到总浸膏，此项工作由广西大学陈希慧教授处理完成。取浸膏5920 g悬浮于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压回收溶剂，得到石油醚部位772 g，乙酸乙酯部位1787 g，正丁醇部位512 g。正丁醇部位过ODS开放柱，甲醇水洗脱（3∶7～1∶0），得到FrsC1～C7，FrsC1 （360 mg）和FrsC2 （230 mg）分别经凝胶柱色谱（氯仿甲醇1∶1）分离得到相应的化合物1（21 mg）和2（15 mg）；FrsC4 （230 mg）经制备型高效液相纯化（甲醇水60∶40），得到化合物5 （18 mg）和6 （13 mg）。乙酸乙酯部位经硅胶柱色谱（氯仿甲醇20∶1～5∶1）分离，得到FrsB1～B9，FrsB4 （313 mg）经制备HPLC纯化（甲醇水65∶35）得到化合物3 （28 mg）和4 （31 mg）；FrsB6 （580 mg）经硅胶柱层析（氯仿甲醇15∶1）分离得到化合物7 （35 mg）；FrsB8 （340 mg）制备HPLC纯化（甲醇水70∶30）得到化合物8 （15 mg）和9 （20 mg）。

3结构鉴定

4细胞毒活性（MTT 法）

收集生长良好的肿瘤细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基配制成5×104个/mL细胞悬液，于96孔培养板内接种，每孔200 μL（含1×105个肿瘤细胞），置37 ℃，5% CO2温箱内培养24 h后弃原液，加入样品溶液200 μL，继续培养48 h，弃去培养液，每孔加入MTT 溶液（50 g·L-1，PBS 配制） 20 μL，37 ℃孵育4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 100 μL，振荡10min，用酶标仪测其吸光度[10]。

采用MTT 法，测定了化合物1～9对7种人肿瘤细胞株：口腔表皮样癌Kb、宫颈癌HeLa、胃癌SGC7901、鼻咽癌CNE2、肺癌A549、卵巢癌SKVO3、甲状腺乳头状癌TPC1细胞株的细胞毒活性，测试结果见表1。

结果显示化合物9对人口腔表皮样癌细胞株Kb呈现一定的细胞毒活性，IC50为2879 μmol·L-1，而化合物1～3，5和7 对该细胞株呈现较弱的细胞毒活性，IC50在3158～4563 μmol·L-1；化合物3和4对人宫颈癌细胞株HeLa呈现强的细胞毒活性，IC50分别为1553，1307 μmol·L-1，而其余化合物对该细胞株呈现较弱的细胞毒活性，IC50在3359～4931 μmol·L-1；化合物5～9对人鼻咽癌细胞株CNE2呈现一定的细胞毒活性，IC50在2363～3946 μmol·L-1；化合物1～3，5和7对人胃癌细胞株SGC7901呈现较弱的细胞毒活性，IC50在3255～4791 μmol·L-1；化合物1，4～6和8对人肺癌细胞株A549呈现中等强度的细胞毒活性，IC50在2263～2996 μmol·L-1，其余化合物对该细胞株呈现较弱的细胞毒活性，IC50在3266～

4285 μmol·L-1；化合物2～4对人卵巢癌细胞株SKVO3呈現强的细胞毒活性，IC50分别为1099，1641，1404 μmol·L-1，化合物1，7，9对该细胞呈现一定的细胞毒活性IC50在2123～3751 μmol·L-1；化合物2～4对人甲状腺乳头状癌细胞株TPC1呈现强的细胞毒活性，IC50分别为1434，1238，1123 μmol·L-1，而化合物1和9对该细胞呈现较弱的细胞毒活性，IC50分别为3979，4570 μmol·L-1。

[参考文献]

[1]崔志学 中国猕猴桃[M] 济南：山东科技出版社，1993

[2]陶爱丽，文祯中，阚云超，等 猕猴桃属植物研究进展[J] 南阳师范学院学报， 2005， 4（3）： 56

[3]Fumiko Abe，Tatsuo Yamauchi Trachelosperosides， glycosides of 19αhydroxyursanetype triterpenoids from Trachelospermum asiaticum[J] Chem Pharm Bull， 1987， 35（5）： 1748

[4]Xu Yixin， Xiang Zhaobao， Jin Yongsheng，et al Two new triterpenoids from the roots of Actinidia chinensis[J] Fitoterapia， 2010， 81： 920

[5]XIN Hailiang， WU Yingchun， XU Yanfeng，et al Four triterpenoids with cytotoxic activity from the leaves of Actinidia valvata[J] Chin J Nat Med， 2010， 8（4）： 260

[6]李火云， 焦珂，张鹏，等 拟缺香茶菜化学成分研究[J] 中草药，2014， 45（2）： 154

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[8]周媛媛，蒋艳秋，孟颖，等 青龙衣活性部位的化学成分研究[J] 中成药，2015， 37（2）： 332

[9]李雯，田新雁，肖朝江，等 黄花香茶菜地下部分化学成分及生物活性研究[J] 中草药，2013， 44（9）： 1091

[10]李杰，刘玉琴 MTT 法肿瘤研究中的改良和应用进展[J] 中国肿瘤临床，1998， 25（4）： 312

[责任编辑丁广治]