热酸水解玉米穗轴及其脱毒处理方法研究

刘秀花,梁梁,李艳旭,梁峰

(商丘师范学院 生物精炼河南省工程实验室，河南 商丘 476000)



热酸水解玉米穗轴及其脱毒处理方法研究

刘秀花,梁梁,李艳旭,梁峰

(商丘师范学院 生物精炼河南省工程实验室，河南 商丘 476000)

对木质纤维原料进行预处理是生产微生物油脂的关键.本试验以最常见的农田废弃物玉米穗轴为原料，对半纤维素水解条件和水解液脱毒方法的选择进行了探究.结果发现，121℃、0.1 MPa、料液比为1∶10、硫酸质量分数为0.7%、处理时间为2 h的条件下稀酸预处理玉米穗轴粉，水解液中还原糖含量最高可达49.68 g/L.经发酵实验证实，采用Ca(OH)2中和后，联合活性炭吸和还原剂进一步脱毒处理上述水解液，水解液中发酵抑制剂的去除效果最好，获得了长枝木霉液体培养油脂产量达到3.188 g/L，具有一定的应用前景.

玉米穗轴；长枝木霉；生物能源；脱毒；微生物油脂

化石能源的枯竭和环境的压力，促使许多政府和组织致力开发可再生能源.其中，生物柴油(脂肪酸烷基酯)在交通运输领域的地位以及它的绿色可再生特性引起人们关注，成为近十多年来的热门话题.生物柴油具有可再生、清洁和安全三大优势，表现为无毒、可生物降解和可再生能源、很低的排气颗粒物和温室气体CO、CO2的排放，因此生物柴油作为一种替代能源有巨大的潜力.生物柴油对中国农业结构调整、能源安全和生态环境综合治理有十分重大的战略意义.促进生物柴油的产业化生产不仅可以帮助国家减少对进口石油的依赖，也可以减轻环境污染和全球变暖的问题.作为一个大型农业国家,中国生物柴油开发可以帮助偏远农村地区恢复生态系统,促进农村经济发展,关注农民、农村和农业，解决“三农问题”[1].

发展生物柴油，我国有十分丰富的原料资源.目前中国生物柴油的开发利用还处于发展初期，要从总体上降低生物柴油成本，使其在中国能源结构转变中发挥更大的作用，只有探索更为经济的方法，才能走符合中国国情的生物柴油发展之路.

世界各国尤其是发达国家，都在致力于开发高效、无污染的生物质能利用技术.欧洲已成为全球生物柴油的主要生产地.而生物柴油产业瓶颈是原料供应问题，传统生物柴油与粮食作物争地，不可持续发展.要满足日益增长的对生物柴油的需求，必须开发脂质如微藻类油和真菌微生物油脂来源.而中国数量庞大玉米穗轴等农作物废弃物可充分地发挥优势，通过水解这类纤维质原料，利用水解液培养微生物来生产微生物油脂，进而转化为生物柴油是一条扩大生物柴油原料来源的新途径.微生物油脂转酯后其成分接近天然石化柴油，具有更高的适用性.由于玉米穗轴水解液中含有许多抑制发酵的副产物，使得用水解液作底物发酵比用纯葡萄糖发酵要复杂得多.酚类化合物、糠醛、乙酸是水解液中几种主要的抑制物，人们尝试了用石灰乳中和[2]、过碱法[3]、活性炭吸附[4]、真空浓缩[5]、有机溶剂萃取[6]和离子交换[7]等多种脱毒方法除去这些抑制物，在改善水解液发酵性能，提高产品得率方面取得了一定的成果.Adnan Cavka等还研究了还原剂的处理对玉米穗轴水解液发酵性能的影响，分析结果表明硫氧化合物等还原剂的积极效应主要是由于他们在低温和弱酸性(如25℃和pH5.5)条件下磺酸盐抑制芳香族化合物和呋喃醛的反应能力[8].但在报道的文献中，多数是以玉米秸秆、甘蔗渣、碎木屑为原料在一定条件下水解，水解液再用上述的脱毒方法之一处理后用于发酵.但研究半纤维素的水解条件以提高其水解率，比较各种脱毒方法以进一步提高水解液发酵性能的文章国内并不多见.所以本试验以最常见的农田废弃物玉米穗轴为原料，对半纤维素水解条件和水解液脱毒方法的选择这两方面进行了探究，以期获得较好的水解条件和脱毒方法.

1 材料与方法

1.1 材料

玉米穗轴取自河南省商丘市郊区，晒干，粉碎过22目筛贮存备用.本试验所使用的长枝木霉13053(Trichodermalongibrachiatum13053)，由本试验室保存，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心.

1.2 主要试剂

1.3 试验仪器

分析天平，高压蒸汽灭菌锅，循环水式真空泵，生物安全柜，恒温鼓风干燥箱，玻璃砂芯过滤装置，低温干燥冻干机，低温培养箱，荧光显微镜，索式抽提装置，电热恒温水浴锅，气浴恒温振荡器.

1.4 研究方法

1.4.1 玉米穗轴热酸解液的制备

称取20 g晒干粉碎并恒重的玉米穗轴于500 mL的锥形瓶中，加入一定体积及一定质量分数的硫酸，高压蒸汽灭菌锅中121 ℃、0.1 MPa条件下水解.水解后冷却至室温，抽滤除去玉米穗轴残渣,得玉米穗轴半纤维素降解液.取样做还原糖含量等定性及定量分析.

在121 ℃、0.1 MPa的条件下，以还原糖含量作为参考指标，选取料液比、硫酸的质量分数、处理时间为考察因素，采用三因素三水平的正交试验方法，得出最优水解条件.

表1 高温高压预处理因素水平表

1.4.2 玉米穗轴半纤维素水解液脱毒

稀酸水解液中产生的发酵抑制物主要包括甲酸、乙酸、糠醛、5-羟甲基糠醛和芳香族化合物等.这些发酵抑制物可以分为3类，即有机酸类、醛类和酚类化合物.

图1 木质纤维素水解产物及其产生的发酵抑制物[12]Fig.1 Hydrolyzate and Fermentation inhibitors of Lignocellulose

三种水解液脱毒方法，分述如下：A.碱过中和法，玉米穗轴酸解液1000 mL，加Ca(OH)2调pH至9.0，30～60 ℃保温1 h，抽滤调pH至5.5.B.碱中和联合活性炭吸附法，玉米穗轴酸解液1000 mL，加Ca(OH)2调节pH至4.0，再加入2.0 g活性炭振荡1 h，然后抽滤，取滤液，调pH至5.5. C.碱中和联合活性炭吸附及还原剂处理法，玉米穗轴酸解液1000 mL，加Ca(OH)2调节pH至4.0，再加入2.0 g活性炭振荡1 h，然后抽滤，取滤液，加入硫代硫酸钠15 mL，震荡10 min，取上清液.

上海理工大学测控专业工程认证教学改革总体思路如图1所示。在以学生为中心的基础上,通过制定培养目标、培养标准、课程计划、教学计划以及保障体系,并通过持续改进,最终实现以输出为导向(Outcome-Based Education,OBE)。改革的具体实施主要分为四个阶段。

1.4.3 DNS法测定还原糖浓度

配制DNS试剂，准确称取3，5-二硝基水杨酸(化学纯)6.3 g于500 mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解后.然后逐步加入262 mL 2 mol/L的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌.直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48 ℃).再逐步加入四水酒石酸钾钠185.0 g、苯酚5.0 g和无水亚硫酸钠5.0 g.继续45 ℃水浴加热，同时补加适量蒸馏水，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解.停止加热，冷却至室温后，移入1000 mL容量瓶中加蒸馏水定容后储存在棕色瓶中，避光保存.室温下放置一周后使用[9-11].将水解液稀释到一定浓度后，在540 nm波长下用分光光度计测定其OD值，根据事先测得的葡萄糖标准曲线计算出水解液中还原糖的浓度.

1.4.4 产油微生物培养

产油培养基配制，向进行过脱毒处理的水解液每1 L中依次加入酵母提取物3.0 g,硫酸镁0.5 g,磷酸二氢钾8.0 g.种子液培养,挑取预先活化的斜面菌种一环,接入种子培养基,250 mL三角瓶装液量为100 mL,于28 ℃、150 r/min条件下培养24 h，收获种子液;发酵培养,以10%(W/V)接种量将种子液接种到250 mL装液量为100 mL的脱毒水解液发酵培养基中,于28 ℃、150 r/min条件下培养7 d.

1.4.5 菌体油脂提取

过滤收获菌体，热酸解法提取发酵产物油脂[13].

2 结果与讨论

木质纤维原料稀酸预处理的原理是稀酸在高温下将半纤维素降解而溶出，从而提高纤维素酶对原料中纤维素的可及度[14-15].

2.1 酸热预处理玉米穗轴的正交试验结果

测定高温酸预处理的水解液中还原糖含量，采用正交试验表格记录其数据.

表2 高温高压预处理正交试验结果

分析表2中的正交试验结果可以看出，121 ℃、0.1 MPa条件下，玉米穗轴稀酸水解液中还原糖含量变化明显，比较3个因素的极差，可确定各试验因素对水解液中还原糖含量的影响，且各个因素对预处理玉米穗轴的影响顺序为：料液比>预处理时间>硫酸质量分数.

根据各组试验因素结果可以看出：A取A1，B取B3，C取C3为好，即121 ℃、0.1 MPa条件下稀酸预处理玉米穗轴最好方法为：A1B3C3(料液比为1∶10，硫酸质量分数为0.7%，处理时间为2 h).

利用玉米穗轴等纤维质原料生产生物柴油具有广阔的应用前景，但真正实现产业化还有许多工作要做，其中玉米穗轴中半纤维素的降解及水解液脱毒效果的好坏对于后续的微生物培养和微生物油脂的产量起着非常重要的作用.

2.2 不同脱毒方法对油脂产量的影响

通过不同的方法对玉米穗轴稀酸水解液进行脱毒处理后，进行微生物产油脂系列试验.表3中列出了各种脱毒方法对霉菌油脂产量的影响，通过对比可以看出，相对于Ca(OH)2中和联合活性炭吸附法、Ca(OH)2过中和法，Ca(OH)2中和联合活性炭吸附及还原剂处理法脱毒效果较好，油脂产量高于另外两种方法.说明这种方法对除去玉米穗轴稀酸水解液中的抑制物有一定的效果，也说明经过脱毒处理的玉米穗轴稀酸联合高温高压预处理的水解液替代葡萄糖作为碳源培养微生物生产生物柴油具备可行性.

表3 不同脱毒方法处理玉米穗轴水解液培养霉菌的产油量

3 讨 论

纤维质原料油脂、酒精等生物燃料的生产主要包括原料预处理、水解液脱毒、微生物培养产油等多个过程，但这些过程相互关联，作为一个整体而存在.预处理是关键，应选择经济实用的预处理方法，从源头减少抑制物的产生.由于原材料及预处理条件不同，预处理液组成有很大差别，应根据水解液中含有的主要抑制剂，选用合适的脱毒方法.但也应当认识到，微生物培养前进行脱毒处理必然会增加生物燃料的生产成本，使工艺过程复杂，同时也会造成部分糖的损失.所以在微生物培养过程中应尽量减少培养前的脱毒处理或者采用经济实用的脱毒方法并应进一步优化其工艺条件.通过筛选或基因工程手段选育高抗性菌株，从而减少或消除抑制作用的影响，应作为未来研究工作的重点.

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[责任编辑：徐明忠]

A condition study of corn cob acid hydrolysis and hydrolysate detoxification

LIU Xiuhua，LIANG Liang，LI Yanxu,LIANG Feng

(Biorefinery Engineering Lab of Hena Province，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，China)

One key point affect microbial oil production is the pre-treatment of lignocellulosic.This study used the most common farm waste——corn cob as raw materials，focused on the hydrolysis conditions of hemicellulose and detoxification method of hydrolysate.Result shows that the reducing-sugar in hydrolysate reached 49.68 g/L，when pre-treated the raw materials under 121 ℃ and 0.1MPa for 2 h with solid-liquid ratio 1∶10 and 0.7% H2SO4.According to the outcomes of fermentation using detoxicated hydrolysate，which was neutralized with Ca (OH)2and absorbed with active carbon，Trichodermalongibrachiatumhad an oil production of 3.188 g/L.This study has potential application prospect.

corn cob；Trichodermalongibrachiatum；bioenergy；detoxification；microbial oil

2017-04-16

河南省重点科技攻关资助项目(132102310039，142102310044)；河南省教育厅自然科学研究项目(13A180830)

刘秀花(1963—)，女，河南新乡人，商丘师范学院教授，主要从事微生物资源、酶制剂、生物能源方面的研究.

TQ925

A

1672-3600(2017)09-0043-04