氧化芍药苷对泡沫细胞胆固醇流出的影响

唐菀泽，马卫列，丁航，向乐，张志珍

（广东医科大学生物化学与分子生物学教研室，广东 东莞 523808）

氧化芍药苷对泡沫细胞胆固醇流出的影响

唐菀泽，马卫列，丁航，向乐，张志珍

（广东医科大学生物化学与分子生物学教研室，广东 东莞 523808）

目的分析氧化芍药苷对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响。方法THP-1细胞加入160 nmol/L佛波酯（PMA）24 h，再加入50 μg/ml乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）建立泡沫细胞模型，CCK-8法测定氧化芍药苷的细胞毒性，同位素标记法测定各处理组泡沫细胞胆固醇流出率。共聚焦显微镜观察泡沫细胞内脂肪分化相关蛋白（ADFP）表达变化，Western blot分析泡沫细胞中ADFP、三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）和过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）蛋白表达变化。结果成功建立THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型。氧化芍药苷毒性分析表明，质量浓度在200.0μg/ml以下无细胞毒性。150.0μg/ml与200.0μg/ml氧化芍药苷处理泡沫细胞，胆固醇流出率分别为（10.317±0.508）%与（11.265±0.713）%，与apoA-1组相比，差异有统计学意义（<0.05），均高于apoA-1组。氧化芍药苷处理的泡沫细胞内ADFP荧光明显减弱。Western blot分析泡沫细胞ADFP表达量降低28%。氧化芍药苷处理组PPARα表达量增加51%，ABCA1表达量增加45%。结论实验表明氧化芍药苷可通过上调PPARα增加ABCA1表达，进而促进泡沫细胞胆固醇流出。

氧化芍药苷；THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞；胆固醇流出

Keywords:Oxypaeoniflora;THP-1 macrophage-derived foam cell;cholesterol efflux

动脉粥样硬化引起的心脑血管疾病是危害人类健康的重要疾病，中国每年死于心血管疾病者近350万例，已成为我国居民的首位死亡原因[1]。胆固醇在巨噬泡沫细胞中积累是动脉粥样硬化形成的关键因素，促进泡沫细胞内胆固醇的逆向转运是防治动脉粥样硬化的有效方法[2]。三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂流向贫脂的载脂蛋白A-1（apolipoprotein A-1，apoA-1），通过增加高密度脂蛋白的形成启动胆固醇逆向转运，进而促进泡沫细胞中胆固醇的外流[3-4]。本课题组前期研究发现，白芍水提物可通过上调泡沫细胞ABCA1蛋白表达，促进细胞内胆固醇的流出。本实验拟在此基础上，以氧化芍药苷作为研究对象，借助人外周血单核细胞系（THP-1）巨噬细胞源性泡沫细胞模型，研究氧化芍药苷对泡沫细胞胆固醇外流的影响，并初步分析其作用机制，为发现新的抗动脉粥样硬化性心血管疾病潜在药物提供实验资料。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

人单核细胞株THP-1购自中南大学湘雅医学院细胞中心，氧化芍药苷购自北京欣荣科技有限公司。RPMI 1640培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司，佛波酯（phorbol-1-myristate-13-acetate，PMA）购自美国Promega公司，乙酰化低密度脂蛋白（acetylated low-density lipoprotein，ac-LDL）购自美国Biochemical Techologies公司，3H标记胆固醇（[3H]-胆固醇）购自美国PerkinElmer公司，apoA-1购自美国Sigma公司。兔抗ABCA1抗体购自美国Sigma公司，兔抗脂肪分化相关蛋白（adipose differentiation-related protein，ADFP）抗体、兔抗过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPARα）抗体购自美国Abcam公司，兔抗GAPDH抗体购自杭州至贤生物公司，HRP标记的山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥公司，驴抗兔Alexa Fluor 555二抗购自广州碧云天生物科技公司，含核荧光染料DAPI的抗荧光淬灭剂购自美国Cell Signaling Technology公司。BCA试剂盒购自广州碧云天生物科技公司，CCK-8试剂盒购自东仁化学科技（上海）有限公司。其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养THP-1细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中悬浮培养。观察细胞生长情况，2～3 d后进行传代培养。

1.2.2 THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立

THP-1细胞传代至6孔板（2×106个/孔），加入PMA至终浓度160 nmol/L，37℃、5%CO2培养24 h，使悬浮细胞分化为贴壁巨噬细胞。更换培养基，加入ac-LDL至终浓度50μg/ml，继续孵育48 h，诱导贴壁巨噬细胞分化为泡沫细胞。同时设PMA对照组。

1.2.3 CCK-8法测定氧化芍药苷的细胞毒性

THP-1细胞接种96孔板（4×103个/孔），按照上述方法建立泡沫细胞模型。每孔加入100μl不同质量浓度的氧化芍药苷（10.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0μg/ml），每个质量浓度设4个平行重复孔，同时设空白对照组和细胞对照组。培养24 h，吸出每孔药物溶液，加入100μl含10%CCK-8的1640培养基，37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h，酶标仪测定450 nm吸光度。根据各组之平均吸光度值计算细胞的存活率。

1.2.4 同位素标记法检测泡沫细胞胆固醇流出率

THP-1细胞接种24孔板（4×105个/孔），PMA作用24 h；加入[3H]-胆固醇（终浓度为0.2μCi/ml）和ac-LDL（终浓度为50μg/ml），5%CO2、37℃培养48 h，诱导细胞分化为泡沫细胞。每孔加入500μl氧化芍药苷溶液（终浓度分别为150.0和200.0μg/ml）作用24 h后，加入含apoA-1的1640培养基（apoA-1终浓度为10μg/ml），继续培养24 h。同时设ac-LDL组和apoA-1组，每组设3个平行重复孔。液体闪烁计数法测定培养基和细胞裂解液中的放射强度，放射强度以cpm值计（cpm值为[3H]-胆固醇放射强度每分钟计数）。泡沫细胞胆固醇流出率按下列公式计算：胆固醇流出率（%）=培养基内cpm/（细胞内cpm+培养基中cpm）×100。参照文献[5]方法进行。

1.2.5 激光共聚焦显微镜观察氧化芍药苷处理的泡沫细胞内ADFP表达变化THP-1细胞接种24孔板（2×105个/孔），建立泡沫细胞模型，同时制作细胞爬片。泡沫细胞加入200.0μg/ml氧化芍药苷作用24 h，再加入apoA-1作用24 h。1×PBS漂洗细胞，加入4%多聚甲醛固定30 min；加入0.1%TritonX-100-PBS冰上透化细胞15 min；加入2%BSA-PBS封闭细胞1 h。加入ADFP抗体（1∶300）4℃过夜；1×PBS漂洗细胞，加入Alexa Fluor 555二抗（1∶1 000），室温避光1 h；滴加含核荧光染料DAPI的抗荧光淬灭剂封片。置激光共聚焦显微镜下观察拍照。参照文献[6]方法进行。

1.2.6 Western blot分析泡沫细胞中ADFP、ABCA1和PPARα的表达THP-1细胞接种6孔板（2×106个/孔），实验分ac-LDL组、apoA-1组和氧化芍药苷处理组。泡沫细胞加入200.0μg/ml氧化芍药苷作用24 h后，加入apoA-1继续培养24 h。提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白含量。12%分离胶进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到PVDF膜上，加入兔抗ADFP一抗（1∶1 000）、兔抗ABCA1一抗（1∶500）与兔抗PPARα一抗（1∶500），4℃过夜，加入HRP标记的二抗（1∶3 000），室温孵育2 h后ECL显色。

1.3 统计学方法

所有实验重复3次。采用SPSS 19.0进行统计学分析，计量资料以均数标准差±s）表示，采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，两两比较用LSD-检验，<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氧化芍药苷对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的毒性

实验中所用的氧化芍药苷纯度在98%以上（见图1和表1）。CCK-8法测定显示，氧化芍药苷质量浓度为300.0μg/ml时，泡沫细胞存活率为（35.375±4.762）%；质量浓度为250.0μg/ml时，泡沫细胞存活率为（52.800±6.004）%；质量浓度为200.0μg/ml时，泡沫细胞存活率为（94.375±2.584）%。氧化芍药苷的半数细胞毒性浓度CC50=250μg/ml，实验结果提示，当质量浓度在200.0μg/ml以下时，氧化芍药苷无细胞毒性（见图2）。

2.2 氧化芍药苷对泡沫细胞胆固醇流出率的影响

ac-LDL组泡沫细胞胆固醇流出率为：（2.116±0.496）%，apoA-1作用泡沫细胞24 h，胆固醇流出率为（8.919±0.953）%。分别用150.0和与200.0μg/ml氧化芍药苷处理泡沫细胞24 h，胆固醇流出率分别为（10.317±0.508）%和（11.265±0.713）%。经单因素方差分析，各处理组的胆固醇流出率差异有统计学意义。进一步两两比较显示，与ac-LDL组比较，apoA-1处理后泡沫细胞胆固醇流出率升高，差异有统计学意义（=12.028，=0.000）；与apoA-1组比较，150.0和200.0μg/ml氧化芍药苷处理泡沫细胞，胆固醇流出率相继升高，差异有统计学意义（=2.472和4.148，=0.039和0.003）（见图3）。后续实验中选用200.0μg/ml浓度进行分析。

2.3 氧化芍药苷处理的泡沫细胞ADFP表达变化

图1 氧化芍药苷的纯度

表1 氧化芍药苷纯度的具体数据

图2 氧化芍药苷对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的毒性测定

激光共聚焦显微镜观察，泡沫细胞内有大量ADFP红色荧光，在整个细胞内呈点状分布（见图4A）。apoA-1处理的泡沫细胞内ADFP荧光明显减弱，且大多集中在靠近细胞膜边缘的位置（箭头所示，见图4B）；而氧化芍药苷处理的泡沫细胞内，ADFP荧光强度相比apoA-1组更弱（见图4C）。

Western blot分析不同处理组泡沫细胞ADFP的表达变化，结果显示，氧化芍药苷处理的泡沫细胞内ADFP蛋白表达明显降低（见图5A）。蛋白灰度分析表明，ac-LDL组、apoA-1组、氧化芍药苷处理组的ADFP相对表达量分别为（1.409±0.051）、（0.983±0.045）及（0.707±0.059），各处理组的ADFP表达差异有统计学意义。进一步两两比较显示，氧化芍药苷处理组的ADFP表达比apoA-1组降低，差异有统计学意义（=6.502，=0.001）（见图5B）。结果提示，氧化芍药苷可介导泡沫细胞内胆固醇的流出。

图3 氧化芍药苷处理的泡沫细胞胆固醇流出率

2.4 泡沫细胞ABCA1与PPARα表达变化

Western blot分析泡沫细胞ABCA1与PPARα的相对表达量。氧化芍药苷处理泡沫细胞24 h后，ABCA1蛋白与PPARα蛋白的表达明显升高（见图6A和图7A）。经单因素方差分析，ac-LDL组、apoA-1组、氧化芍药苷处理组的ABCA1表达差异有统计学意义；氧化芍药苷处理的泡沫细胞ABCA1的相对表达量为（1.500±0.022），进一步与apoA-1组比较，氧化芍药苷处理组ABCA1蛋白表达升高，差异有统计学意义0.000）（见图6B）。

图5 泡沫细胞ADFP表达

图6 泡沫细胞ABCA1表达

图7 泡沫细胞PPARα表达

3 讨论

动脉粥样硬化是一种以胆固醇在动脉内膜沉积为特征的慢性疾病。巨噬细胞源性泡沫细胞的形成在动脉粥样硬化发生和进展中起到关键作用。促使胆固醇从巨噬细胞中外流对阻止泡沫细胞形成以及防止动脉粥样硬化的发生和发展具有重要意义[7]。

白芍来源于双子叶植物毛茛科芍药属植物的干燥根，为我国传统中药及临床常用药物之一。现代医学对白芍药理的研究多侧重于其对神经、消化、免疫等系统的作用，而其对心血管系统的研究报道较少。研究发现白芍总苷能提高组织细胞中cAMP水平，抑制炎症因子产生[8]；白芍制剂可明显抑制中性粒细胞cAMP-PDE活性，而发挥抗炎症效果[9-10]。魏毅等[11]发现黄芪多糖与白芍总苷配伍可有效促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内脂质流出，而确切作用机制未见报道。白芍的有效部位包括芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷及羟基芍药苷等一系列糖苷类物质[12]。本研究在前期实验中，以水与95%乙醇作为提取溶剂，通过水提醇沉，旋转蒸发、浓缩等方法得到白芍提取物。研究发现白芍水提取物有促进泡沫细胞胆固醇流出作用，故本实验进一步选取白芍单体—氧化芍药苷作为研究对象，分析其对泡沫细胞胆固醇流出的影响及可能的机制。

氧化芍药苷细胞毒性实验得知，其半数细胞毒性浓度CC50为250.0μg/ml，质量浓度200.0μg/ml以下无细胞毒性，且200.0μg/ml氧化芍药苷对泡沫细胞胆固醇流出有明显作用，故后续实验中，选取200.0μg/ml作为实验浓度。与apoA-1组比较，氧化芍药苷处理组胆固醇流出率增加26%，提示氧化芍药苷有促进泡沫细胞胆固醇流出作用。为了验证此实验结果，进一步采用激光共聚焦显微镜观察氧化芍药苷处理的泡沫细胞内ADFP的表达变化。ADFP是一种脂肪分化相关蛋白，是apoA-1介导的胆固醇流出通路中的转运囊泡的组成部分[6]，是THP-1巨噬细胞脂质沉积和动脉粥样硬化病变的标志性物质[13-14]。共聚焦显微镜观察到ac-LDL泡沫细胞组有大量ADFP红色荧光蛋白表达，且在整个细胞内点状分布，apoA-1组及氧化芍药苷处理组红色荧光相继减弱且多集中于细胞膜边缘位置。同时，采用Western blot方法分析泡沫细胞内ADFP的表达变化，氧化芍药苷处理后ADFP表达量较apoA-1组降低28%。ADFP的镜下观察与Western blot实验结果均提示，氧化芍药苷具有促使泡沫细胞胆固醇流出的作用。

高密度脂蛋白介导胆固醇从巨噬泡沫细胞流出是清除细胞内过量胆固醇的最主要途径，胆固醇以囊泡分泌形式进行转运，在此过程中有apoA-1的介导[15]。大量研究证实，ABCA1是细胞内胆固醇和磷脂转运到apoA-1的主要运输者，这一步骤是体内新生高密度脂蛋白颗粒形成的必须步骤。PPARs是一种调控糖类和脂质代谢的核受体，在哺乳动物中有3种亚型：PPARα、PPARβ和PPARγ。其中PPARα高表达于脂肪酸代谢旺盛的组织如心脏、肝脏、肾脏、肌肉和动脉血管壁中的各种细胞如巨噬细胞及内皮细胞。PPARs已被实验证实具有抗动脉粥样硬化的作用[16]。PPARα被相应配体活化后，能够增强脂肪酸的β氧化；而且PPAR为ABCA1的转录因子，PPARα增加伴随着ABCA1表达量提高，说明PPARα能够正向调节ABCA1的表达，促进胆固醇的流出。本实验中Western blot分析PPARα蛋白表达变化，与apoA-1组比较，200.0μg/ml氧化芍药苷处理泡沫细胞后，PPARα表达量增加51%，同时ABCA1表达量上调45%。提示，氧化芍药苷可通过上调PPARα、进而促进基因表达增加泡沫细胞的胆固醇流出。该研究结果为开发抗动脉粥样硬化有效新药提供了实验数据。

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（张蕾编辑）

Effect of Oxypaeoniflora on cholesterol efflux from foam cells

Wan-ze Tang,Wei-lie Ma,Hang Ding,Le Xiang,Zhi-zhen Zhang
(Department of Biochemistry and Molecular Biology,Guangdong Medical University,Dongguan,Guangdong 523808,China)

ObjectiveTo analyze the effect of Oxypaeoniflora on cholesterol efflux from THP-1 macrophagederived foam cells.MethodsTHP-1 cells were treated with 160 nmol/L phorbol-1-myristate-13-acetate(PMA)for 24 h,then 50 μg/ml acetylated low-density lipoprotein(ac-LDL)to establish foam cell model.Cytotoxicity of Oxypaeoniflora was assessed by CCK-8.Cholesterol efflux rate of the foam cells in each treatment group was evaluated by isotope labeling method.The expression of adipose differentiation related protein(ADFP)in the foam cells was observed by confocal laser scanning microscopy.The expression changes of ADFP,ATP binding cassette transporter A1(ABCA1)and peroxisome proliferator-activated receptor alpha(PPARα)in the foam cells were detected using Western blot.ResultsThe THP-1 macrophage-derived foam cell model was successfully established.At the concentration of lower than 200.0 μg/ml,Oxypaeoniflora was not cytotoxic.When the Oxypaeoniflora concentrations were 150.0 μg/ml and 200.0 μg/ml,the cholesterol efflux rates were about(10.317±0.508)%and(11.265±0.713)%respectively,which were increased compared with the control group(<0.05).Under microscope,the fluorescence of ADFP in the Oxypaeoniflora groups was obviously decreased.Western blot indicated that the expression of ADFP was decreased by 28%,while the expressions of PPARα and ABCA1 were increased by 51%and 45%respectively.ConclusionsThe results state clearly Oxypaeoniflora can increase the expression of ABCA1 by up-regulation of PPARα expression and then promote the cholesterol efflux from foam cells.

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.002

1005-8982（2017）16-0006-06

R282；Q54

A

2017-01-03

张志珍，E-mail：zzzhang@gdmu.edu.cn