HBV基因突变及其临床意义研究进展

刘灿，欧启水

(福建医科大学附属第一医院检验科，福州 350005)

·综述·

HBV基因突变及其临床意义研究进展

刘灿，欧启水

(福建医科大学附属第一医院检验科，福州 350005)

HBV以准种形式存在患者体内，不同基因区的准种变化具有明显的异质性，其对疾病的诊断、治疗及转归均有一定影响。理解HBV突变及其改变的分子及病理特征，有助于实现不同乙肝感染患者的分层管理，促进更精准的个体化治疗。该文就HBV基因突变及其临床意义研究进展作一综述。

HBV；基因；突变；临床意义

HBV为部分双链环状嗜肝DNA病毒，基因组含4个部分重叠的开放读码框(open reading frame，ORF)，即前-S/S区、前-C/C区、P区和X区。HBV侵入机体后脱衣壳形成松弛环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)，进入靶细胞核内，在DNA聚合酶作用下合成共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)，再经过RNA聚合酶转录成各种大小不同的mRNA，其中前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)在HBV逆转录酶作用下合成完整的HBV DNA，其他mRNA则翻译成病毒的各种蛋白质成份(见图1)[1]。根据HBV基因组序列差异性>8%和S基因序列差异性>4%，可将HBV区分为至少10个基因型(A～J型)及若干个基因亚型，我国主要以B、C基因型感染为主[2]。然而，由于HBV逆转录过程缺乏严格的校正机制，每104～105核苷酸就会出现1个突变。因此，每一个患者体内的病毒构成并不均一，而是由HBV基因序列存在微小差异的多种病毒株组成，并始终处于动态变化过程中，即以准种(quasispecies)形式存在[3]。HBV准种的异质性变化包括复杂性和多样性改变[4]，不同基因型HBV的准种异质性变化对疾病的诊断、治疗及转归均有一定的影响。本文就HBV不同基因区的突变、抗病毒疗效及临床转归的关系等作一综述。

注：本图在文献[1]基础上修改而成；NTCP，钠离子/牛磺胆酸共转运多肽；rcDNA，松弛环状DNA；cccDNA，共价闭合环状DNA；pgRNA，前基因组RNA。

图1 HBV感染流程

1 前-S/S区基因突变及其临床意义

HBV前-S/S区基因包括preS1区、preS2区和S区，分别有各自的起始密码子，但共用一个终止密码子[5](见图2A)。前-S/S区基因主要编码3种包膜蛋白：大蛋白、中蛋白和主蛋白，分别又称L、M和S蛋白。preS1因基因亚型的不同而造成编码氨基酸长度不固定，由108至126个氨基酸构成，此区域包含与肝细胞结合受体钠离子/牛磺胆酸共转运多肽(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide， NTCP)的结构域，在病毒感染进入细胞中起重要作用[6]。preS2由55个氨基酸组成，与T、B淋巴细胞免疫表位识别有关[7]。S区基因由226个氨基酸组成，包括N端区(aa1～98)、主要亲水区(major hydrophilic region，MHR，aa99～169)和C端区(aa170～226)，负责编码HBsAg，是病毒包膜蛋白的主要抗原区域[7]。

前-S序列是整个HBV基因组中异质性最高的区域，突变类型包括替换、缺失和插入等多种形式，见表1。相对于B基因型，preS1/preS2区突变更常发生于HBV C型感染患者[5]。S区基因突变主要集中在MHR，发生在“a”决定区(aa124～147，能诱导机体针对所有HBV亚型产生保护性应答的区域)的突变，可改变HBsAg的空间构象引起抗原性质改变，无法被抗HBs抗体中和，成为免疫逃逸突变；发生在“a”决定区以外的突变，除了发生免疫逃逸外，还常常影响肝脏疾病进展及核苷(酸)类似物(NAs)耐药的发生，见表1。前-S/S区基因突变也会对临床HBsAg检测造成影响[8]。如产生的HBsAg无法被商品化试剂检出，容易出现HBsAg/抗HBs抗体双阳性的结果，甚至造成隐匿性肝炎(occult hepatitis B virus infection，OBI)的发生[9]。另一方面，不同的检测系统对突变株的检测能力不一[10]。Servant-Delmas等[11]比较了13种商品化试剂检测HBsAg的结果，发现对不同类型突变株不同试剂检测结果间存在差异，其总体检出率从62.9%～97.9%不等。因此，当临床对HBsAg检测结果持有疑议时，应尽可能采用另一种方法进行复检。

S区基因与HBV逆转录酶区基因重叠，有研究利用二代测序平台(next generation sequencing，NGS)如超深焦磷酸测序(ultra-deep pyrosequencing, UDPS)等在NAs治疗患者中发现了一些新的低比例(0.13%～0.17%)突变位点，如sW156stop、sW163stop、sW165stop和sW191stop等[12-13]，会导致HBsAg合成缺陷。然而，这些低比例突变的确定临床意义目前尚不明了。

注：A，前-S/S区基因结构； B，前-C/C区基因结构及编码产物； C，HBV P区基因结构；D，HBV X区基因结构；nt，核苷酸；rt，逆转录酶；aa，氨基酸；MHR区，主要亲水区；NRD负向调控原件。

图2 HBV各基因区结构

注：*，终止密码；突变碱基前未加“nt”均代表氨基酸位点(全文同)。

2 前-C/C区基因突变及其临床影响

HBV前-C/C区基因依据各自的起始密码子，在基本核心启动子(basal core promoter，BCP)引导下，转录成preC mRNA和pgRNA，前者翻译成前核心蛋白和核心蛋白，进而剪切成HBeAg和HBcAg[5](图2B)。文献报道HBV前-C/C区基因的异质性常发生在BCP和前-C区，见表2。BCP和前-C区突变会促进HBeAg血清学转换，因此早期检出BCP和前-C区突变可以预测HBeAg的血清学转换[24]。与HBeAg阳性患者相比，HBeAg阴性患者更易发生前-C区突变，而且这些突变并不引起DNA拷贝数的变化，但与肝脏疾病进展密切相关[25]。有研究显示，BCP/前-C区突变可能对抗病毒药物具有更高的敏感性[26-27]，但如果BCP/前-C突变联合前-S1/S2缺失，往往会导致更严重的肝脏疾病如暴发性肝炎和HCC的发生[28]。而且，BCP/前-C区突变与基因型相关，好发于HBV基因型B和D感染的患者[29]。

表2 常见BCP、前-C/C区突变及临床影响

最近有研究利用高灵敏UDPS技术，分析BCP、前-C/C区基因的异质性，发现在基线水平即存有少量G1896A、G1899A和前-C区起始密码子突变，并随疾病进展不断变化[26]；Bayliss等[32]利用NGS检测HBeAg阳性患者发现，基线水平存在少量可检测的BCP/前-C突变，会显著降低NAs治疗后HBsAg的清除率。

3 P区基因突变及其临床意义

P区是最长的HBV基因区，包含4个功能结构域：末端蛋白(terminal protain，TP)、间隔区(spacer region, Spc)、逆转录酶(RT)区和RNA酶H区(RNH)，其中RT区又可分为7个结构域(图2C)。P区编码DNA聚合酶，参与HBV DNA的合成及pgRNA的逆转录。TP位于P区N端，作为DNA负链合成的初始引物；Spc区作为聚合酶功能非必要的补充，更能耐受突变，由于间隔区与前-S区部分交叉，因此该区域变异亦会引起相应的HBsAg氨基酸位点的改变；RT区具备DNA聚合酶活性和逆转录活性，其催化中心位于nt736～747(即YMDD区)，该区在所有基因型中高度保守，在HBV复制中发挥着重要作用；RNA酶H区位于P区C端，参与RNA的衣壳包装和负链DNA的合成[34]。

抗病毒治疗药物NAs主要通过竞争结合HBV DNA聚合酶尤其是RT区，发挥强效抑制病毒复制的作用，一旦该区基因发生变异，就会导致NAs结合力下降，从而失去对突变株的抑制能力，产生耐药[35]。因此，以往研究最多的HBV P区异质性主要集中在RT区，见表3。与干扰素治疗相比，A、B基因型较C、D基因型具有更好的应答效果，然而基因型差异对NAs的疗效应答情况目前仍知之甚少[2]。

表3 常见RT区突变及临床影响

注：LMV，拉米夫定；ADF，阿德福韦酯；ETV，恩替卡韦；TDF，富马酸替诺福韦酯；LdT,替比夫定；ETV耐药相关变异是在rtM204V/I+rtLl80M变异基础上，再联合其他至少一个位点的氨基酸替代变异；*，仅在体外实验发现，在临床实践中并未完全确认TDF的耐药位点。

本课题组曾构建高灵敏RT-AS-LNA-qPCR[44]和RT-ARMS-qPCR[45]技术，分别用于HBV YIDD(rtM204I)和YVDD(rtM204V)突变株的定量检测，初步揭示了早期检出低比例突变DNA对NAs的疗效预测价值。近来有研究利用NGS平台显示，NAs治疗的CHB患者其HBV RT区准种异质性呈现多样性及低比例变化的趋势[5,46-48]。进一步研究发现，选择LAM或LdT治疗4周时，应答组RT区准种复杂性和多样性显著低于无应答组[46]，采用ETV时，完全应答组较部分应答组准种复杂性降低，而准种多样性增加[5,48]，提示不同准种异质性对药物的动力学和药效学变化有影响；而且高基线水平RT 2区(与S区基因重叠的B、C结构域)的准种异质性可预测病毒学应答[47]。尽管如此，这些在基线水平及NAs治疗过程中出现的低比例耐药突变，其确切的临床意义仍未完全阐明。

4 X区基因突变及其临床意义

X区是HBV最小的基因区，N端含负向调控域(negative regulatory domain，NRD)，具有抗凋亡基因；C端为转录因子结合区(transcription factor binding)，含促凋亡基因[49]。其编码产物HBx蛋白不与宿主及病毒DNA直接结合，主要通过激活或抑制转录因子对HBV DNA病毒转录、复制及宿主细胞基因起调控作用，是导致肝癌发生的关键分子[50]。X区基因突变主要发生在肝癌患者，有研究显示，当存在K130M+V131I双联突变及V5M/L+K130M+V131I三联突变时，HCC的风险分别提高3.75倍和5.34倍[51]。鉴于X区基因突变与HCC密切相关，有研究利用测序技术，发现当8个X区基因位点(包括ntG1613A，ntC1653T，ntT1753V，ntA1762T，ntG1764A，ntA1846T，ntG1896A和ntG1899A)出现≥6个突变位点阳性作为预测HCC的指标，其敏感性为44.0%，特异性可达99.7%[52]。

目前，单独针对X区基因的二代测序研究较少。研究显示与前-C区重叠的X区基因(nt 1 814～1 838)中，当存有少量(0.16%)ntT1836C突变时，会导致原有的终止密码子TAA突变为编码谷氨酰胺的密码子CAA，从而产生的HBx蛋白的羧基末端比正常HBx多51个氨基酸，致使HBx蛋白发生潜在的功能性改变[26]。

5 小结与展望

HBV基因组具有明显的准种异质性，有些与病毒治疗反应有关，有些与免疫逃逸相关，有些可加速肝脏疾病进展，有些会引起检测结果不一致。因此，借助于分子诊断技术的发展及临床研究的深入，能进一步了解不同HBV基因突变的临床意义，尤其是证实一些低比例突变的时空特性，更好地针对不同的乙肝感染个体做出精准医疗决策。

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(本文编辑：周万青，刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.11

国家自然科学基金(81572067，81672101)；福建省自然科学基金(2015J01385)。

刘灿，1979 年生，男，博士研究生，主要事乙型肝炎病毒诊断与疗效监测研究。

欧启水，主任技师，教授，博士研究生导师，E-mail：ouqishui@163.com。

R446.6

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2016-12-20)