阑尾周围脓肿中检出未分类新型链球菌1例

杨锐，屈平华，陈东科

(1.张掖市甘州区人民医院检验科，甘肃张掖 734000；2.广东省中医院/广州中医药大学第二附属医院检验医学部，广州 510006；3.北京医院检验科，北京 100730)

·案例分析·

阑尾周围脓肿中检出未分类新型链球菌1例

杨锐1，屈平华2，陈东科3

(1.张掖市甘州区人民医院检验科，甘肃张掖 734000；2.广东省中医院/广州中医药大学第二附属医院检验医学部，广州 510006；3.北京医院检验科，北京 100730)

阑尾；脓肿；新型链球菌

随着16S rRNA基因序列分析为代表的分子生物学技术在细菌分类鉴定中的广泛应用，链球菌(Streptococcus)的菌群划分发生了很大变化。原先一些链球菌群先后被划分出，独立成属，如肠球菌属、孪生球菌属、乳球菌属、乏养球菌属、颗粒链菌属等；同时，一些新的菌种不断被分离、命名和补充增加，成为链球菌属的新成员[1]，如中华链球菌(S.sinesis)[2]、香港链球菌(S.hongkongensis)[3]。我们于2013年3月自1例急性化脓性阑尾炎患者阑尾周围脓肿中分离出1株链球菌，经16S rRNA基因测序，初步鉴定为一未分类的新型链球菌，报道如下。

1 病历摘要

患者，男，50岁。2013年2月因右下腹疼痛，伴恶心、呕吐数次，当地医院诊断为阑尾炎，输液治疗后疼痛缓解(具体药物不详)。2013年3月4日，右下腹疼痛再次发作，且逐渐加重，伴恶心，无呕吐，以“慢性阑尾炎急性发作”收入本院。患者有慢性阻塞性肺病、肺结核、肺大泡、胸膜炎、冠心病等基础疾病。入院查体：体温38.6 ℃，脉搏72次/分钟，呼吸20次/分钟，血压120/80 mmHg；腹部平坦，未见腹壁静脉曲张，未见肠型及蠕动波，腹软，右下腹压痛明显，反跳痛存在，无肌紧张，未扣及包快，肝脾肋下未触及，Murphy征阴性；肝肾区扣击痛阴性，移动性浊音阴性，肠鸣音正常，结肠充气试验阴性，腰大肌试验阴性，闭孔内肌试验阴性。血液常规检查：WBC 7.5×109/L，N 77.8%，L 12.8%，M 9.4%。腹部超声检查提示：右下腹混合性包块。急诊在硬膜外麻醉下行阑尾切除术，术中见阑尾发黑，坏疽，周围形成脓肿，抽吸脓液做细菌培养，检出大肠埃希菌和链球菌各1株。术后给予头孢吡肟抗感染治疗，并止血、补液对症治疗，7 d后患者切口愈合良好出院。

2 细菌培养鉴定

无菌抽取脓汁接种哥伦比亚血琼脂平板(英国Oxoid公司)和麦康凯平板(英国Oxoid公司)，其中哥伦比亚血琼脂平板放入CO2产气袋(法国生物梅里埃公司)中，35 ℃培养24 h后观察到2种菌落：一种为湿润、扁平、灰白色的直径约2 mm的大菌落，涂片革兰染色(珠海贝索公司)镜检为革兰阴性杆菌；另一种为圆形突起、边缘整齐、半透明、湿润、易乳化、β溶血、菌落直径约0.5 mm的小菌落，涂片革兰染色为革兰阳性球菌，呈成双或成短链排列。麦康凯平板上则仅生长一种菌落，其发酵乳糖，呈桃红色，菌落直径和形态与哥伦比亚血琼脂平板上生长的阴性杆菌一致。革兰阴性杆菌经法国生物梅里埃公司ID 32E试条鉴定为大肠埃希菌，生物编码为54465743420，鉴定百分率99.9%，T值为0.93。革兰阳性球菌触酶试验阴性、吡咯烷酮芳基酰胺酶(PYR)试验阳性、CAMP试验阴性、精氨酸水解试验阳性、V-P试验阳性、6.5%NaCl肉汤生长、杆菌肽耐药、复方磺胺甲噁唑敏感。采用法国生物梅里埃公司Lancefield血清F群凝集，Rapid ID 32 Strep条鉴定为豕链球菌，生物编码3732305110，鉴定百分率为99.9%，T值为0.7。在硫乙醇酸盐液体培养基(杭州天和公司)中呈颗粒状沉淀生长，上层澄清。采用16S rRNA基因通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′和1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增[4]。PCR产物送上海英骏广州分公司进行测序，获得>1 400 bp的有效序列(部分峰图见图1)。测序序列在EzBioCloud(http://www.ezbiocloud.net/ eztaxon/)进行比对，结果显示该菌与假豕链球菌、香港链球菌和豕链球菌的相似度较高，分别为98.0%、97.5%和97.3%。按Stackebrandt等[5]2006年修订的16S rRNA基因低于99.2%的新分类单元标准，初步鉴定为一未分类的新菌种。

图1 16S rRNA部分测序结果

3 讨论

链球菌属内种别多、分类方法多，种间鉴别较复杂，传统的鉴定方法技术复杂，影响因素多，商品化鉴定系统和仪器有时难以将菌种准确区分鉴定，尤其一些不常见和新型菌株，仅依靠形态学和生化反应等表型特征难以准确识别和鉴定。以16S rRNA基因测序技术为代表的分子鉴定方法是传统表型鉴定方案之外的常用替代方案，特别是在临床不常见菌、苛养菌和新发现的细菌鉴定中[6]。16S rRNA基因测序鉴定是在细菌进化和亲缘关系基础上对已有菌种进行的一种序列相似性分析，其相对于传统表型分析方法而言更具客观性和准确性。目前，针对临床细菌和真菌的基因测序鉴定，美国临床实验室和标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)已制定了相应的指南文件[7]。随着国内16S rRNA基因测序技术的迅速开展和普及，国内临床微生物室人员亦应认真对待少见的触酶阴性革兰阳性球菌，并结合16S rRNA基因测序技术做出正确的分类鉴定。

[1]陈东科, 孙长贵. 实用临床微生物学检验图谱[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2011: 194-208.

[2]Woo PC, Tam DM, Leung KW,etal.Streptococcussinensissp. nov., a novel species isolated from a patient with infective endocarditis[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(3): 805-810.

[3]Lau SK, Curreem SO, Lin CC,etal.Streptococcushongkongensissp. nov.isolated from a patient with an infected puncture wound and from a marine flatfish[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2013, 63(Pt 7): 2570-2576.

[4]屈平华, 赵红波, 黄彬, 等. 卫生部微生物室间质评1012菌的鉴定与放线菌属的系统发生分析[J].中华检验医学杂志, 2011, 34(9): 814-819.

[5]Stackebrandt E, Ebers J. Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards[J]. Microbiol Tod, 2006, 33(4): 152-155.

[6]陈茶, 屈平华, 顾全, 等. 基于细菌16S rRNA 基因的PCR 扩增与测序分析在临床不常见菌鉴定中的应用[J]. 中华检验医学杂志, 2012, 35(7): 612-619.

[7]Clinical and Laboratory Standards Institute. Interpretive criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing. CLSI document MM18-A[S]. Wayne, PA: CLSI, 2008.

(本文编辑：周万青，刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.21

杨锐，1972年生，男，副主任技师，大学本科，主要从事临床微生物检验工作。

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2017-03-17)