基于代谢组学慢性心力衰竭肾阳虚证代谢模式的研究

郑海生，蒋 健

(1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021)

【中医多学科研究】

基于代谢组学慢性心力衰竭肾阳虚证代谢模式的研究

郑海生1，蒋 健2△

(1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021)

目的： 探讨基于色谱/质谱联用(LC/MS)及模式识别为主的代谢组学技术及其方法，研究慢性心力衰竭肾阳虚证的代谢模式及相应代谢网络的变化。方法： 收集正常人以及临床常见慢性心力衰竭肾阳虚证与气阴两虚证病例的尿样，以LC/MS为代谢组学研究方法，检测分析各组间尿样中代谢模式的差异。结果：代谢组学研究表明，与正常组比较慢性心衰组有21种内源性化合物含量与正常组有明显不同；与气阴两虚组比较，慢性心力衰竭肾阳虚组有16种内源性化合物含量与气阴两虚组有明显不同。结论：以代谢模式改变为依据的代谢组学研究方法，通过代谢通路成功地将不同证型加以区分，说明代谢组学技术及其方法研究中医学证本质的思路及方法可行，从代谢模式的角度阐述中医证本质是中医现代化可实践和深化的技术和方法学体系。

肾阳虚证；证本质；代谢组学；同病异证

代谢组学正处于快速发展阶段，日益成为研究的热点。高通量、高分辨率的分析技术与生物信息学相整合，对生物代谢层面进行研究提供了解生物体的独特视角。代谢组中各代谢产物水平的高低与发育、生理、病理状态有关，代谢组是一个细胞或组织的生物化学表现型[1](the biochemical phenotype of a cell or tissue)。代谢组学通过整体、动态的方法研究人体生理病理状态，可把与脏腑生理病理密切相关代谢产物的变化反映出来。

本研究将从临床慢性心力衰竭(CHF)肾阳虚病人着手，探讨临床肾阳虚病例与非肾阳虚病例之间不同的代谢网络变化模式，试图找到这些疾病共性的代谢途径，即肾阳虚代谢组学特征谱，探究中医证候学在代谢网络层面的生物学本质，为寻找中西医结合治疗这些疾病提供思路和途径。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2008年6月至2008年12月上海市曙光医院心内科确诊的慢性心衰患者72例，其中肾阳虚组38人，年龄(65.12±6.78)岁；气阴两虚组24人，年龄(68.43±10.60)岁；正常对照组48人，年龄(67.56±11.26)岁。所有样本排除应激及冠心病、溶血性疾病、肝肾功能异常及感染者、精神病患者;妊娠或哺乳期妇女。各证型组患者年龄、病程、心衰水平分级比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 入组标准

慢性心力衰竭的西医诊断标准参照Framingham心力衰竭标准[2]。慢性心力衰竭中医肾阳虚证诊断标准参照《中药新药临床研究指导原则》[3]。正常对照组入选标准：健康体检者经详细体检及胸透、心电图、血压、血尿常规、血糖、肝肾功能等理化检查，评定无心、脑、肝、肾、肺和内分泌等主要器官系统的实质性病变者。

2 检测仪器及方法

2.1 检测仪器

实验仪器、材料及试剂由上海交通大学分析测试中心提供。色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、色谱纯甲酸均购自Merck公司；Waters 中国有限公司超高效液相色谱单级四极杆飞行时间串联质谱联用仪(UPLC/QTOFMS型号Acquity Ultra Performance LC-Q-TOF premie)、Waters 中国有限公司UPLC C18色谱柱 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Millipore中国有限公司Milli-Q超纯水系统(型号Milli-Q Adventage)Waters中国有限公司MassLynx操作系统。所用试剂氯甲酸乙酯(ECF)、氯仿、无水乙醇、吡啶、氢氧化钠、无水硫酸钠皆为分析纯，购自上海润洁化学试剂有限公司。内标：L-2-氯苯丙氨酸，购自美国SIGMA公司。

2.2 尿液样品的采集及预处理

采集纳入研究的慢性心力衰竭和慢性肾功能衰竭患者的肾阳虚证和非肾阳虚证及健康对照者的空腹晨尿(用样品桶收集患者入院当日晚上12∶00至次日晨8∶00的尿液混匀)约10 ml,置于15ml有盖圆底塑料离心管，立即放置于低温冰箱-80℃冷冻保存待实验。在实验前将尿液样品取出，常温下解冻、摇匀，采集2 ml放入离心机5000 r/min(rpm)离心5 min，进行LC-MS分析。

2.3 流动相条件

试验中流动相设定为流动相A:水+0.1%甲酸；流动相B:乙腈+0.1%甲酸。

2.4 UPLC/QTOFMS分析条件

质谱条件：以氮气作为雾化、锥孔气；电喷雾电离正离子模式；飞行管检测模式V型；毛细管电压(capillary voltage) 3.5 kV；锥孔电压(Sampling cone) 35v；萃取锥孔(Extraction cone) 3v；源温 (Source temperature) 100℃；脱溶剂气温度(Desolvation temperation) 400℃；反向锥孔气流(Cone gas flow) 50l/h；脱溶剂气(Desolvation gas flow) 600 l/h；低质量区分辨率(Lm resolution) 4.7v；高质量区分辨率(Hm resolution)15v；离子能量(Ion energy) 0；碰撞能量(Collision energy) 6v；碰撞池入口(Collision cell entrance) 2v；碰撞池出口(Collision cell exit) -10v；碰撞气流速(Collision gas flow) 0.5 mL/min；检测器(Detector) 1700v；扫描时间(Scan time) 1s；扫描时间间隔(Inter scan time) 0.02s; 质荷比范围：50～1000 m/z。

表1 流动相洗脱梯度

2.5 代谢组学数据处理和统计学分析

数据的提取方法用UPLC/QTOFMS配套的MarkerLynx (waters)软件，进行基线矫正、峰判别与匹配、内标和系统杂峰的排除和峰的归一化等计算过程，最终得到由指定的峰序列号(保留时间/质荷比)、观测点(样品号)以及归一化后峰面积组成的三维矩阵数据集，导入Simca-P12.0软件进行OPLS-DA(正交偏最小二乘法判别)分析，运用变量投影重要性分析(VIP, variable importance for the projection)方法区分组间代谢轮廓贡献较大的代谢物。多维统计中找到的差异代谢物，应用SPSS 17. 0统计软件进行Kruskal-Wallis检验和单因素ANOVA分析验证，结合VIP值大于5并差异有统计学意义(P<0.05)的代谢物确定为潜在标记物。

3 结果

3.1 各组尿液代谢物分析在同一保留时间，各组尿液色谱峰大小、高低表达有差异(图1)。模式识别分析结果显示，正常对照组与慢性心力衰竭组尿液代谢物呈明显的分离趋势 (图2)，慢性心衰肾阳虚组与气阴两虚组尿液代谢物完全分离(图5)。

图1 心衰病人与正常人尿样UPLC/QTOFMS总离子流图

图2 正常组与慢性心衰组尿液代谢组学PLS-DA得分图注：CLASS1=正常组，CLASS2=心衰组

图3 正常组与慢性心衰组尿液SIMCA-P12.0-PLS分析结果负载图

图4 VIP>5的物质28个，其中能初步鉴定20个

图5 慢性心衰中肾阳虚VS气阴两虚尿液代谢组学PLS-DA得分图注：CLASS1=气阴两虚，CLASS2=肾阳虚

图7 S_PLOT VIP>5共21个，可以初步鉴定的物质16个

3.2 潜在标记物采用UPLC/QTOFMS自带的相似性匹配软件结合保留时间，将正常组与慢性心力衰竭各个峰归属为特定的物质，找到2组共有的内源性物质29种(图3)；慢性心衰肾阳虚组与气阴两虚组共有内源性物质21种(图6)。进一步用OPLS-DA法对正常组与慢性心衰组尿液样本共有的29种代谢物重新建模，寻找VIP>5的高度相关代谢物。通过NISTOS标准质谱图库和标准品对照进行质谱信息匹配，对可能的代谢标记物进行初步鉴定。与正常组比较，慢性心衰组有21种内源性化合物含量与正常组有明显不同(图4)。为寻找与各中医证型高度相关的代谢物，用OPLS-DA法对慢性心衰肾阳虚组与气阴两虚组尿液样本共有的21种代谢物重新建模，寻找VIP>5的高度相关代谢物，与气阴两虚组比较，慢性心衰肾阳虚组有16种内源性化合物含量与气阴两虚组有明显不同(图7)。

4 讨论

本功研究显示，从单个病种的研究中，慢性心力衰竭患者的代谢模式图与正常组在空间分布上呈分离趋势，并得到可以确认的21种含量不同的代谢产物，即代谢组学技术成功地进行了“辨病”。 进一步以慢性心力衰竭肾阳虚组和气阴两虚组进行研究发现，慢性心力衰竭患者的肾阳虚组和气阴两虚组代谢模式图在空间分布上呈分离趋势，并得到2组间可以确认的16种含量不同的代谢产物，提示利用代谢组学技术及方法可以实现中医证型的区分，达到“辨证”的目的。

从代谢组学所得到的这些不同的差异代谢物是各个代谢途径中能反映整体信息的一些关键信息点，其可以从能量代谢、微量氨基酸代谢、肠道菌群代谢等具体的代谢网络途径，由点到面地区分了慢性心力衰竭患者肾阳虚组与气阴两虚组不同的代谢模式，同时这些差异性代谢物可反映与具体病理生理相对应的代谢网络发生异常后物质和功能的改变。这种以组学阐释的方式可以更好地将中医证型所具有的多层次、复合性物质变化与整体观得以明确的表达。

与实验室生化指标相比，这种以系统整体的角度通过代谢网络层面阐述病与证的不同代谢模式的技术及方法更适合运用于中医证型本质的探讨与研究。由于其以组学的形式和相互关联的多个代谢标志物来进行相关病与证的不同的代谢模式的区分，与实验室经典生化指标相比，其可以顾及一般生化指标中不被关注，但极可能是反映“证”概念特点的重要物质。并通过研究其对应的相关代谢通路，探究并发现与“证”概念相关的代谢模式，便于我们更深入地了解具有整体性与复合性的中医“证”概念所反映的病理生理过程中物质和功能的变化过程。本次的代谢组学研究结果说明，这种组学研究方法在区分不同病或证上已体现出方法学的优势，这也可能同样对于具有相近证概念(如脾阳虚证)提供了相应的方法学支持，而弥补或改观单纯靠实验室指标所呈现的区分“证”型指标特异性差的特点。从本次对慢性心力衰竭病证结合研究结果可验证，代谢组学方法在中医证型研究中的方法学优势与可行性。本研究从代谢组学小分子水平初步反映了慢性心力衰竭肾阳虚证、气阴两虚证代谢特征，从生物代谢角度为研究中医证候的现代内涵提供了实验依据，以期为中医证候本质研究作出有益的探索。

[1] 邱德有，黄璐琦.代谢组学研究-功能基因组学研究的重要组成部分[J].分子植物育种，2004，2(2)：165-177.

[2] 张建，华琦. 心力衰竭的诊断与治疗[M].北京：人民卫生出版社，2006:173-175.

[3] 郑筱萸. 中药新药临床研究指导原则[M].北京：中国医药科技出版社，2002:80-81.

【临床基础】

Kidney-Yang Deficiency Metabolic Mode Research in Chronic Heart Failure Based on Metabonomics

ZHENG Hai-sheng1，JIANG Jian2△

(1.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004，China; 2.DawnHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200021,China)

Objective: To investigate kidney yang deficiency metabolic patterns and metabolic networks changes by metabolomics which based on GC/MS and pattern recognition. It is to construct a methodology to suitable for TCM’s syndrome theories. Methods: Collecting urine samples of chronic heart failure patients who appear kidney yang deficiency syndrome and Qi deficiency and Yin deficiency syndrome. Then their different metabolic patterns is to be distinguished metabolic profiling changes. 72 patients were divide into 2 groups: 38 chronic heart failure cases in the kidney deficiency syndrome group,24 chronic heart failure cases in the Qi deficiency and Yin deficiency syndrome group,48 normal people to be treated as control group. And collecting the first time urine samples after hospitalization is to be collected and applied to study metabolic pattern change of control group，kidney Yang deficiency and Qi deficiency and Yin deficiency syndrome. Results: The metabolomics indexes showed chronic heart failure and control group’s metabolomic pattern graph distribute different area, at the same time chronic heart failure kidney yang deficiency group and Qi deficiency and Yin deficiency syndrome group metabolomic pattern graph also distribute different area. Conclusion: The metabolomics is showed chronic heart failure and normal people can be distinguished by LC/MS. Meanwhile chronic heart failure and chronic kidney failure disease’s kidney yang deficiency and non-kidney yang deficiency can be distinguished by LC/MS. They discriminate kidney yang deficiency and non-kidney yang deficiency different metabolomic pattern. The results certificate metabolomics technology can be applied in the investigation of TCM syndrome. This technology should be expanded and strengthened.

Kidney yang deficiency； Syndrome essence；Metabolomics；Same syndrome for different diseases

国家自然科学基金资助项目(30572286)-基于代谢组学的肾阳虚证本质的研究

郑海生(1975-)，男，甘肃渭源人，副教授，医学博士，从事中医内科理论研究。

△通讯作者：蒋 健(1956-)，男，江苏苏州人,主任医师，医学博士,从事中西医结合内科消化病研究，Tel: E-mail:

R541.6+1

A

1006-3250(2017)05-0645-03

2016-10-21