紫外分光光度法测定肝素含量的研究

张云 黄敏菊 袁秦 李继彦 国家食品药品监督管理局广州医疗器械质量监督检验中心 （广东 广州 510663）

紫外分光光度法测定肝素含量的研究

张云 黄敏菊 袁秦 李继彦 国家食品药品监督管理局广州医疗器械质量监督检验中心 （广东 广州 510663）

亚甲蓝与肝素发生络合反应，在664nm处出现特征峰，肝素含量与吸光度值呈良好的线性关系，用紫外分光光度法制作标准曲线，计算肝素钠的含量。并且测得的肝素含量具有良好的重复性，是快捷简便的定量分析方法。

肝素 亚甲蓝 分光光度法 采血管

1.引言

肝素是一种含有硫酸基团的粘多糖[1]，带有强大的负电荷，具有加强抗凝血酶III灭活丝氨酸蛋白酶的作用，从而阻止凝血酶的形成，并有阻止血小板聚集等多种抗凝作用。肝素一般情况下对相关指标都不会有干扰，同时抗凝比例较大（抗凝剂：全血=1:30），对血液基本没有稀释影响，所以肝素及其相关产品广泛用于抗凝药物，肝素抗凝是最常用的抗凝剂。近年来有研究证明肝素钠还有降血脂的作用，肝素钠在医疗器械产品中的应用非常广泛且还有广阔的发展空间。

肝素管一般用于生化及血流变的检测，是电解质检测的最佳选择。常见的肝素抗凝管主要是肝素钠和肝素锂，也有少数用肝素铵，但检验血标本中的钠离子时，不能使用肝素钠，以免影响检测结果。也不能用于白细胞计数和分类，因肝素会引起白细胞聚集。采血管的注册检验依据是YY0314-2007《一次性使用人体静脉血样采集容器》，在行标中对肝素管中肝素含量有具体明确的规定，所以对肝素含量的检测尤为重要。但在行标中没有对肝素检测方法作具体的规定，企业可以自行制定检验方法，通常从结果的准确性、检验条件和可操作性等方面进行考量。

目前，肝素含量的测定方法有分光光度法[2-3]、荧光法、共振瑞丽散射法、高效毛细管电泳法。荧光法对实验要求较高，操作时要尽量避光，且操作时间尽量短，实验成本较高；共振瑞丽散射法检测限低，适用于痕量肝素钠的检测；高效毛细管电泳法只能用于检测临床肝素钠在血液中的含量，且由于不同生物个体的影响，实验收到限制；分光光度法由于操作简便、结果准确有效，是最常用的检测方法。由于大部分企业是使用紫外分光光度法检测，本实验对采用紫外分光光度法测定肝素锂、肝素钠的含量进行研究，对两者的测定结果进行比较，提供切实可行的操作方案，提高实际检测工作的效率。

图1. 肝素钠结构式

图2. 亚甲蓝结构式

肝素钠（Heparin Sodium），是由猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质。亚甲蓝（Methylene blue）化学式：C16H18N3ClS，又称亚甲基蓝、次甲基蓝、次甲蓝、美蓝、品蓝，是一种芳香杂环化合物。水溶液呈蓝色，常被用作化学指示剂、染料、生物染色剂和药物使用。

2.实验部分

2.1 仪器及试剂

紫外吸光度仪（岛津公司）、电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）、超纯水仪（Milli-Q公司）、亚甲蓝（天津市大茂化学试剂厂）、肝素钠标准品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、肝素锂标准品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

2.2 试验方法

2.2.1 标准溶液的制备

精密称取肝素钠/肝素锂标准品适量，加水溶解制成每1ml约含1.25IU的溶液，作为标准贮备液。精密量取标准贮备液0ml、1.0ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0ml分别于25ml容量瓶中，各加入1.0ml亚甲蓝溶液（0.1g/L），加水稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液（浓度分别为0.05 IU/ml、0.10 IU/ml、0.15 IU/ml、0.20 IU/ml、0.25IU/ml），室温放置1小时，待测。

图3. 肝素钠标准曲线

图4. 肝素锂标准曲线

2.2.2 试样溶液制备

精密称取一定量肝素钠加水溶解，移至25ml容量瓶中，加入1.0ml亚甲蓝溶液（0.1g/L），加水稀释至刻度，摇匀，作为试样溶液。得到0.16 IU/ml、0.24 IU/ml三种浓度试样溶液，室温放置1小时，待测。

2.2.3 测定方法

以水作为参比，测定各标准溶液和试样溶液在664nm波长处的吸光度。全部溶液应于1小时之内测完。

表1. 肝素钠试样溶液测定结果测得浓度(IU/ml) 平均值(IU/ml) 标准偏差1# 2# 3# 4# 5# 6# 0.08 0.0790 0.0800 0.0795 0.0790 0.0795 0.0795 0.0794 0.000376 0.16 0.1595 0.1605 0.1595 0.1600 0.1605 0.1605 0.1600 0.000492 0.24 0.2410 0.2405 0.2400 0.2405 0.2405 0.2410 0.2406 0.000376试样溶液浓度(IU/ml)

表2. 由肝素锂标准曲线计算的肝素钠试样溶液结果测定浓度(IU/ml) 平均值(IU/ml) 标准偏差1# 2# 3# 4# 5# 6# 0.08 0.0790 0.0795 0.0800 0.0790 0.0795 0.0795 0.0794 0.000376 0.16 0.1595 0.1605 0.1595 0.1605 0.1600 0.1600 0.1600 0.000447 0.24 0.2410 0.2405 0.2400 0.2405 0.2405 0.2410 0.2406 0.000376试样溶液浓度(IU/ml)

图5. 不同浓度肝素与亚甲蓝反应的紫外吸收结果

2.2.4 结果计算

以标准溶液的浓度对吸光度进行线性回归，求出回归方程，再根据回归方程计算出试样溶液中肝素钠/肝素锂的含量。

3.结果和讨论：

已有文献研究表明[4]，一定浓度的肝素与亚甲蓝反应，紫外分光光度计在566nm处和664nm处各检测到一个特征吸收峰，如图5[4]所示，紫外吸光度随肝素含量增加而发生变化，所以通过对已知含量的肝素钠（锂）溶液测得的吸光度对肝素含量作标准曲线，计算得到样品中肝素的含量。而在相同实验条件下，664nm处的峰值变化比566nm处的峰值变化灵敏一倍，本次实验在664nm处进行测试。

1、带负电荷的肝素阴离子与亚甲蓝发生缔合反应，通过吸光度计算得到肝素钠和肝素锂含量，计算所得结果重复性较好，偏差较小。

2、0.05 IU/ml～0.25 IU/ml的浓度范围内[3]的肝素钠和肝素锂的紫外吸光度与其相对应的肝素含量均具有良好的线性关系，并具有良好的重复性。

3、相同浓度肝素钠、肝素锂所测得的紫外吸光度值相近，肝素钠的标准曲线也可以进行肝素锂含量的测定。用肝素钠的标准曲线计算所得的肝素锂含量，与肝素锂标准曲线计算所得的肝素锂含量结果相近，误差在可接受范围内。

4.结论

对肝素产品进行肝素含量测定时，用肝素钠作的标准曲线，同样可以准确得到样品中肝素锂的含量，由于肝素钠、肝素锂在于亚甲蓝发生反应时，是肝素阴离子与亚甲蓝的络合，阳离子对其不产生影响，据此推测，本方法在测定其他肝素产品的含量时也有参照作用，用不同于样品的其他肝素标准品作标准曲线，计算样品中肝素的含量。这对不易购买到标准品的相关肝素样品的测定提了供较为方便可靠的操作方法，在对采血管的肝素含量检测中提供了更高效便捷的操作方法，在保证检测结果准确的前提下，提高检测效率，具有广泛的应用意义。

[1] 方井晋.肝素钠有关物质检测方法学研究及效价的快速测定[D].浙江大学,2012.

[2] 刘秀英,张超灿,徐卫林.甲苯胺蓝分光光度法测定肝素钠的研究[J].化学试剂,2009,3(4):271-274.

[3] 柳轶男,莫秀梅,何创龙,等.甲苯胺蓝法测定肝素钠含量的校准曲线研究[J].光谱实验室,2009,26(2):278-280.

[4] Jiao QC,Liu Q,Sun C,et al.Investigation on the binding site in heparin by spectrophotometry [J].Talanta,1999,48(5):1095–1101.

Research on Detemination of Heprin by UV Spectrophotometry

ZHANG Yun HUANG Min-ju YUAN Qin LI Ji-yan Guangzhou Medical Instruments Quality Supervision and Inspection Center of State Food and Drug Adiminastration
(Guangdong Guangzhou 510663)

According to the reaction btween heparin sodium and methylene blue, there is the absorption peaks at 664nm. The content of heparin and its absorbance keep a linear relation , so we can utilize UV spectrophotometry standard curve to caculate the results of heparin sodium. The method has been applied to analyze the samples and the results are satisfactory.

heparin, methylene blue, spectrophotometry, blood collection tube

1006-6586(2017)14-0019-03

R927.2

A

2017-06-22