拜氏梭菌细胞固定化技术的研究

岳雨霞

摘 要：该文以海藻酸钠和聚乙烯醇（PVA）为载体，以戊二醛为交联剂，对拜氏梭菌进行了固定化技术的研究。通过单因素实验和正交实验，以总溶剂和丁醇产量及固定化小球的完整性为考核指标，确定了影响拜氏梭菌固定化技术的主要工艺参数：海藻酸钠浓度为2%，PVA浓度7%，戊二醛添加量为2%，交联时间4 h，交联温度37 ℃，丁醇产量最高可达11.72 g/L，总溶剂产量最高可达21.51 g/L。

关键词：海藻酸钠 PVA 交联 拜氏梭菌 固定化

中图分类号：Q81 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2017）06（a）-0139-02

固定化细胞技术是20世纪70年代兴起的一种新型生物技术，是指利用物理或化学手段将游离的细胞或酶与固态的不溶性载体相结合，使其保持活性并可反复使用的一种技术[1]。该技术可以大幅度提高催化效率，减少所用微生物数量，微生物被高分子材料包埋，耐环境冲击，产物易分离提取，操作稳定性好[2]。因此，固定化细胞技术在发酵工业中具有广阔发展前景[3]。

微生物细胞的固定方法中吸附法具有操作简单、固定化条件温和、细胞活性损失小、载体可反复使用等优点，被广泛应用和研究。海藻酸钠具有化学稳定性好、无毒、包埋效率高等优点，适用于固定活细胞或敏感细胞，但其不耐热，易破碎溶解，凝胶强度不够，不利于多次使用。而聚乙烯醇凝胶强度较高，化学稳定性好，抗分解性能强，同时戊二醛能和细胞表面的基团发生交联并形成网状结构从而得到机械强度好的凝胶，因此，将PVA和海藻酸钠结合，同时采用戊二醛[7]交联可以使优势得到加强。

文章以海藻酸钠和PVA为载体，采用戊二醛交联后吸附拜氏梭菌进行细胞固定化，研究了载体成球方式和固定化方法对溶剂产量的影响。

1 实验材料与方法

1.1 菌种

拜氏梭菌，实验室保藏菌种。

1.2 培养基

1.2.1 种子培养基

完全培养基（g/L）：酵母浸粉3.0 g，牛肉膏10.0 g，胰蛋白胨10.0 g，可溶性淀粉1.0 g，葡萄糖5.0 g，L-半胱氨酸0.50 g，NaCI 5.0 g，NaAc 3.0 g，pH8.5。斜面培养基另加琼脂20.0 g/L。121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 基本发酵培养基

P2培养基（g/L）：葡萄糖，酵母粉，P2营养液。

P2营养液组成：（1）维生素液（g/L）：对-氨基苯甲酸0.10 g，硫胺素0.10 g，生物素0.001 g，（2）微量元素液（g/L）：KH2PO4 50.0 g，K2HPO4 50.0 g，NH4COOH 22.0 g，MgSO4.7H2O 20.0 g，MnSO4.H2O 1.0 g， FeSO4.7H2O 1.0 g，NaCl 1.0 g。0.45 μm滤膜过滤灭菌。接种前将P2营养液以一定比例加入P2培养基中。

1.3 培养条件

1.3.1 种子培养

菌种由固体斜面接入种子培养基，39 ℃静置培养24 h。

1.3.2 发酵培养

种子培养液75 ℃恒温水浴下热处理10 min后接种入发酵培养基，39 ℃下静置培养72 h。

1.4 主要仪器设备

实验中主要的仪器设备有：蒸汽灭菌器、电热培养箱、气相色谱、超声波清洗器、离心机、精密电子天平。

1.5 试剂

实验中使用的主要试剂有：硼酸、酵母浸提物、氯化钙、海藻酸钠、氢氧化钠、乙醇、氯化钠、戊二醛、丙酮、丁酸等。

1.6 固定化工艺

1.6.1 工艺流程

载体→溶解→固化交联→吸附菌体→发酵

1.6.2 操作要点

（1）溶解：先将PVA与海藻酸钠浸泡6～12 h，再加热溶解，灭菌备用。

（2）固化交联：吸取PVA与海藻酸钠溶液，无菌环境下滴入已配置好的含戊二醛和氯化钙的硼酸饱和溶液中使成小球，设定温度下静置一段时间。

（3）吸附菌体：在无菌三角瓶中，将小球与菌液吸附一段时间后倒出菌液。

（4）发酵：将培养基倒入三角瓶中，39 ℃静置培养72 h，检测溶剂产量。

1.7 分析方法

1.7.1 溶剂产量的测定

（1）标准曲线的制作。

计算：根据溶剂和内标的峰面积比和质量比，结果如下：

乙醇：y=1.4546x-7E-05，R2=0.9991

丙酮：y=1.3689x-0.0343，R2=0.9984

丁醇：y=1.0491x-0.047，R2=0.9966

式中：x为与内标的峰面积比，y为与内标的质量比。

（2）样品中溶剂的检测。

发酵液12 000 r/min离心10 min后，取上清液，与内标异丁醇混合后采用气相色谱仪进样检测。色谱柱为KB-5MS，25 m×0.53 mm×1.00 μm；检测器FID；进样口温度240 ℃；检测器温度260 ℃；柱温80 ℃（保温5 min）～120 ℃（保温3 min）；进样量1μL。

1.7.2 pH值的测定

用pH计测定溶液pH值。

2 结果与分析

在单因素实验基础上，进行正交实验，分析结果可知：影响结果的顺序，为交联时间>交联联温度>PVA浓度>戊二醛浓度，最佳配比A2B2C2D3，即PVA浓度为7%，戊二醛浓度为2%，交联时间4 h，交联温度37 ℃，此时丁醇产量可达11.72 g/L，总溶剂产量最高可达12.51 g/L。

3 结语

（1）单因素实验结果表明，PVA为7%，海藻酸钠2%，戊二醛2%，固定化交联时间4 h，固定化交联温度37 ℃时，丁醇和总溶剂产量较高。

（2）正交实验的确定了固定化交联条件：PVA浓度为7%，戊二醛浓度为2%，交联时间4h，交联温度37 ℃，此时丁醇产量可达11.72 g/L，总溶剂产量最高可达21.51 g/L。

（3）由于时间的原因未对固定化条件、固定化小球特性、固定化小球的回收利用等进行详细研究，需要在以后的工作中多查阅文献合理安排时间。

参考文献

[1] 肖美燕，徐尔尼，陈志文.包埋法固定化细胞技术的研究進展[J].食品科学，2003，24（4）：158-161.

[2] 蒋宇红，黄霞，俞毓馨.几种固定化细胞载体的比较[J].环境科学，1993，14（2）：11-15.

[3] 张磊，张烨，侯红萍.固定化细胞技术的研究进展[J].四川食品与发酵，2006（1）：5-7.

[4] Chen BY.Revealing threshold criteria of biostimulation fordye-laden wastewater treatment using immobilized cell sys—tems[J].Process Biochem.，2007（42）：158-166.