基于线粒体D—loop序列的泰山赤鳞鱼多态性分析

闫莉莉++于杰++赵富丽++洪敏++程妍++孟超

摘 要：通过对24条泰山赤鳞鱼DNA提取、PCR技术对线粒体D-loop序列进行扩增。PCR产物经纯化并进行序列测定后，得到的核苷酸片段约900 bp。运用MEGA5.10软件计算其成对序列遗传距离，并根据D-loop序列建立了邻接法（Neighbor-Joining，NJ）系统树。通过DNASP软件计算出这24个个体的遗传多样性参数其多态性参数为：多态位点数（S）为71，单倍型个数（H）为19，单倍型多样性（h）为0.96，核苷酸多样性（π）为0.011 12，平均核苷酸差异数（k）为8.739。研究发现泰山赤鳞鱼具有较高的单倍型多样性，但其核苷酸多样性较低。所构建NJ系统树拓扑结构基本一致，24个个体均形成两大分支，由于线粒体DNA属于母系遗传，由此可推断该群体的24个个体可能来源于两个不同的母系祖先。

关键词：赤鳞鱼 线粒体DNA D-loop 系统树

中图分类号：S86 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2017）06（b）-0245-02

泰山赤鳞鱼又名螭霖鱼，属鲤科，突吻鱼属，是泰山的著名特产。2013年被列入国家二级保护动物[1]。它分布的海拔一般是270～800 m，对高、低温也不适应，对水质的要求高。它生长缓慢，游速快，而且不容易人工养殖。具有极高的营养价值和特殊的药用价值，含有12种以上矿物质、18种以上的脂肪酸，其中抗衰老的多种不饱和脂肪酸含量尤其丰富[2]，可减轻动脉粥样硬化、贫血等。

自20世纪80年代以来，由于泰安降雨量的减少、旅游资源开发、人工过度捕撈等众多因素的影响，赤鳞鱼野生资源急剧减少，濒临灭绝。为研究保护其种群的正常生长、繁殖，该研究采集了来自泰山不同地方的赤鳞鱼样品，分析了其种群多态性，为该鱼种群的保护管理提供参考。

1 实验过程

（1）选取泰山不同地区24条大小体重相近的泰山赤鳞鱼。

（2）分别将≤30mg切碎的肾脏组织放置已经灭菌的1.5 mL离心管中，利用试剂盒方法提取DNA。

（3）用琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

（4）设计引物，引物为DL-F：5`-ACCCCTGGCTCCC AAAGC-3，DL-R：5`-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3`[3]。

（5）PCR扩增：扩增体系：DNA 1.0 uL、上游引物1.0 uL、下游引物1.0 uL、dNTP Mixture 2.0 uL、10×Buffer 2.5 uL、Taq DNA聚合酶0.6 uL、去离子水16.9 uL、合计25 uL。扩增程序：94°C 5 min、94°C 30sec、54°C 1 min、72°C 2 min 72°C 10 min，30 cycle。

（6）PCR产物经纯化后测序。

2 结果分析

该实验共测定了24条赤鳞鱼的线粒体DNA控制区即D-loop（Displacement loop）基因片段，其碱基序列为900bp左右。A、T、C、G四种碱基在24个个体的平均含量分别为A32.45%，T33.3%，C21.8%，G13.45%。AT含量高于CG含量，可见，赤鳞鱼mtDNA中碱基T含量最高，碱基G含量最低，与脊椎动物mtDNA碱基组成一致。

以24个个体D-loop序列构建的NJ[4]系统树分别如图1所示。

应用MEGA5.10软件[5]，根据线粒体D-loop序列算出24个个体间的遗传距离，个体间的平均遗传距离为0.011 4。通过DNASP软件[6]计算出这24个个体的遗传多样性参数为：多态位点数（S）为71，单倍型个数（H）为19，单倍型多样性（h）为0.96，核苷酸多样性（π）为0.011 12，平均核苷酸差异数（k）为8.739。由此可以看出，该群体具有较高的单倍型多样性，但核苷酸多样性较低。

3 讨论

通常序列分析（测序）是最为有效的揭示遗传结构的方法[7]。线粒体DNA具有分子小而稳定、母系遗传、进化速率快特点，成为群体遗传学的理想分子标记[8]。研究表明，泰山赤鳞鱼具有极高的单倍型多样性（0.96）。但其核苷酸多样性（0.011 12）较低。该研究中样本的D-loop序列所构建NJ系统树表明，两种方法所得到的系统树的拓扑结构基本一致，24个个体均形成两大分支，由于线粒体DNA属于母系遗传，由此可推断该群体的24个个体可能来源于两个不同的母系祖先。

该研究对泰山赤鳞鱼的遗传多样性研究的结果表明，其线粒体D-loop区存在较丰富的多样性。

参考文献

[1] 庞秋香，赵博生，陈艳艳.泰山赤鳞鱼苹果酸酶同工酶表型差异的研究[S].安徽农业科学，2010，38（1）：59-62.

[2] 汪艳宏.赤鳞鱼生长激素全长cDNA克隆和结构功能分析[D].山东农业大学，2012.

[3] Wang CG，Liu H， Liu ZZ，et al.Mitochondrial genetic diversity and gene flow of common carp from main river drainages in China[J].Freshwater Biol，2010（55）：1905-1915.

[4] Saitou N.and M. Nei. The neighbor-joining method：A new method for reconstruct of phylogenetic trees[J]. Mol Biol Evol， 1987（4）：406-425.

[5] Tamura K， Peterson D， Peterson N， et al. MEGA5： Molecular Evolutionary Genetic Analysis using Maximum Likelihood， Evolutionary Distance， and Maximum Parsimony Methods[J].Mol Biol Evol， 2011（28）：2731-2739.

[6] Rozas J， Sanchez-Delbarrio C J， Messeguer X， et al. DnaSP， DNA polymorphism analyses by coalescent and other methods[J].Bioinfomatics， 2003（19）：2496-2497.

[7] Buonnacorsi VP， Mc Dowell JR， Graves JE. Reconciling patterns of inter-ocean molecular variance from four classes of molecular markers in blue marlin （Makaira nigricans） [J]. Mol Ecol， 2001（10）：1179-1196.

[8] Aquadro CF， Greenberg BD. Human mitochondrial DNA variation and evolution： analysis of nucleotide sequences from seven individuals[J]. Genetics， 1983， 103： 287-312.