不同采收期葛根中总黄酮含量的动态变化研究

裴莉昕　纪宝玉　陈随清

[摘要] 目的 研究同一产地、不同采收期葛根中总黄酮含量的动态变化情况，确定葛根的最佳采收期。方法 采用紫外-可见分光光度法，取供试品用95%乙醇回流提取20 min，于250 nm处测定其吸光度，计算总黄酮含量。 结果 不同月份采收的葛根中总黄酮的含量范围为3.79%～11.86%，以9～10月最高，4～5月最低。 结论 以总黄酮为评价指标，葛根的最佳采收期应为9～10月，该结果可为葛根采收期的确定提供了可靠的科学依据。

[关键词] 葛根；总黄酮；动态变化；采收期

[中图分类号] R965 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（a）-0028-03

[Abstract] Objective To study the dynamic change of total flavonoids content of Radix Puerariae in the same area and different harvest times， and determine the best harvest period of Radix Puerariae. Methods UV-Vis spectrophotometry was used， the test sample was extracted with 95% ethanol for 20 min， the absorbance was measured at 250 nm， and the total flavonoid content was calculated. Results The content of total flavonoids in Radix Puerariae harvested in different months was 3.79%-11.86%， the highest from September to October， the lowest from April to May. Conclusion As to the total flavonoids as the evaluation index， the best harvest period of Radix Puerariae should be September to October， the results can provide a reliable scientific basis for determining root harvest period.

[Key words] Radix Puerariae； Total flavonoids； Dynamic change； Harvest period

葛根為豆科（Leguminosae）植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]的干燥根，明朝著名医学家李时珍对野葛进行了系统的研究，认为野葛的茎、叶、花、果、根均可入药。《本草纲目》中记载：“葛，性甘、辛、平、无毒，主治：消渴、身大热、呕吐、诸弊，起阴气，解诸毒”[1]。葛根具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻之功效，主要活性成分是异黄酮类化合物，其总异黄酮类化合物含量是葛属植物中最高者。包括大豆（黄豆）苷、大豆苷元、葛根素等10余种成分[1]；并含有胡萝卜苷、氨基酸、香豆素类等[2-3]。野葛分布广，资源丰富，主要分布在河南、云南、湖北、陕西、浙江、湖南、四川等省，除西藏、青海等少数几个省份外，全国大部分省份都有分布，但是以长江流域和黄河流域各省自然分布较多。

葛根总黄酮在国内外研究和应用也已有多年，具有明显扩张冠状动脉、预防心律失常等作用，临床广泛应用于预防和治疗动脉粥样硬化、偏瘫、大脑萎缩、降血脂、降血压、防治糖尿病、突发性耳聋乃至醒酒等，除了入药之外，葛根还具有多方面的保健功能，例如调节内分泌，提高免疫力，抗衰延年、调经养颜，对女性更年期症状，如便秘、面部色斑、痛经、月经不调、乳腺疾病及骨质疏松等症均有较好的疗效，因而越来越引起人们的关注[4-7]。但葛根药材总黄酮成分的现代研究方向多为临床药效和药理方面[8-11]，对其动态积累的研究较少[12-13]，因此本实验系统研究了同一产地、不同采收期（12个月）的葛根总黄酮含量变化情况，为葛根的合理采收提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

AB135-S十万分之一分析天平（梅特勒）恒温干燥箱、UV-2201型紫外分光光度计（岛津）、KQ-500DV数控超声波清洗器（昆明市超声仪器有限公司）、葛根素对照品（11075200511，中国药品生物制品检定所，纯度为99%）、蒸馏水、95%乙醇（分析纯，天津市化学试剂三厂）、甲醇（分析纯，天津市化学试剂三厂）。

1.2 材料

样品采自河南省太行山区，采收时间分别为2013年1～12月的12批三年生葛根样品。经河南中医药大学生药学科陈随清教授鉴定为豆科（Leguminosae）植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]的干燥根。

2 方法与结果

2.1 提取条件的优化

2.1.1 提取溶剂浓度的选择 取药材粉末约0.1 g（过3号筛），精密称定，置50 mL具塞平底烧瓶中，分别精密加甲醇、65%乙醇、95%乙醇各10 mL，称定重量，加热回流提取1 h，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足重量，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量。结果分别为9.06%、5.44%、9.58%，95%乙醇提取总黄酮效果明显好于65%乙醇提取，而甲醇与95%乙醇的提取效果差不多，考虑到甲醇毒性较大，故本实验采用95%乙醇作为提取葛根总黄酮的溶剂。

2.1.2 提取时间的选择 取药材粉末约0.1 g（过3号筛），精密称定，置50 mL具塞平底烧瓶中，精密加95%乙醇10 mL，称定重量，分别加热回流提取10、20、30 min，放冷，再称定重量，用95%乙醇补足重量，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量，结果分别为4.27%、8.99%、9.02%，回流提取20、30 min时两种成分的含量基本没有变化，表明回流提取20 min基本达到充分提取，因此本实验选用回流提取20 min。

2.1.3 提取方法的选择 取药材粉末约0.1 g（过3号筛），精密称定，置50 mL具塞平底烧瓶中，精密加95%乙醇10 mL，称定重量，分别加热回流提取与超声提取各20 min，放冷，再称定重量，用95%乙醇补足重量，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量，结果分别为9.62%、7.78%，表明加热回流提取比超声提取效率更高，因此本实验选用加热回流提取。

2.2 对照品溶液的制备

取葛根素对照品适量，精密称定，加95%乙醇制成每毫升含20 μg的溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备

取葛根粉末约0.1 g，精密称定，置于50 mL三角瓶中，加95%乙醇30 mL，加热回流20 min，并时时振摇，放冷，再称定重量，用95%乙醇补足减失的重量，摇匀，吸取上清液1 mL于10 mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。

2.4 最大吸收峰的确定

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各适量，以1 mL 95%乙醇加水至10 mL量瓶中，作为空白对照，于200～500 nm波长扫描，结果均在250 nm处有最大吸收。精密吸取供试品溶液，以1 mL 95%乙醇加水至10 mL量瓶中，作为空白对照，于200～500 nm波长扫描，结果均在250 nm处有最大吸收。见图1。

2.5 测定方法

取供试品于250 nm处测定其吸光度，并按外标法计算供试品溶液中总黄酮的含量。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 精密称取葛根素对照品适量，置量瓶中，用95%乙醇溶解至刻度，摇匀，分别制成0.004、 0.008、0.012、0.016、0.02 mg/mL的对照品储备溶液，在250 nm测定吸收值，以葛根素浓度（mg/mL）为横坐标（X），吸收度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得线性回归方程为：Y=77.15X+0.0923，r = 0.9997，表明总黄酮在0.004～0.02 mg/mL的范围内，浓度与吸收度呈良好的线性关系。

2.6.2 精密度试验 精确称取总黄酮对照品溶液，在250 nm测定吸光度，重复测定6次，结果吸光度的RSD值为2.44%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，在制备后0、2、4、6、8、10、12 h时分别测定吸光度，结果吸光度的RSD值为2.36%，表明供试液在12 h内基本稳定。

2.6.4 加样回收率试验 取已知含量的同一样品粉末6份，各约0.05 g，每份样品中加入适量葛根素对照品，按“2.3”项下方法制备供试液，在250 nm下测定吸光度，计算回收率，结果回收率平均值为98.1%，RSD为1.28%，表明该实验方法的回收率良好。见表1。

2.6.5 重复性试验 精密称取同一样品粉末6份，各0.1 g，按“2.3”项下制备供试液，在250 nm下测定吸光度，计算总黄酮含量，结果RSD值为2.09%，表明该实验方法重复性良好。

2.7 不同采收期葛根药材中总黄酮的含量测定结果

取不同月份采收的葛根药材按“2.3”项下制备供试品溶液并测定其吸光度，计算葛根总黄酮含量。结果见表2。

3 讨论

3.1 为了避免产地带来的影响，我们选择同一产地的葛根进行研究，结果表明，一年中不同月份采收的葛根总黄酮含量存在差异。4～6月总黄酮含量最低，可能由于此时温度适宜、雨量充沛，植物地上部分处于快速生长阶段，营养主要供于地上植物生长，因此导致根部总黄酮含量较少；9～10月总黄酮含量最高，可能由于此时进入冬季，地上植物枯萎，所有营养集中供给地下部分，此时根部总黄酮含量较高。从结果可知，9～10月的秋季采收葛根药材最佳，与传统葛根药材采收期一致。

3.2 对于葛根中总黄酮的提取方法，研究表明，醇提法效果比较好，优于水提法和其他方法，这主要是由于葛根总黄酮类化合物更易溶于醇溶媒中的缘故。通过优化，得总黄酮最佳提取条件为95%乙醇回流提取20 min。

3.3 中药质量的好坏，取决于有效物质含量的多少，有效物质含量的多少与采收期密切相关，因此药材采收期是中药材生产中的重要环节，直接影响药材的质量与产量。药材适宜采收期确立以质量最优和产量最大化为基本原则。药材品质优良的主要评价指标是药物的活性成分的组成和量。葛根主要活性成分是葛根素、大豆苷、大豆苷元等黄酮类物质。本实验对不同采收期葛根总黄酮含量进行了研究，所得结果为确定葛根采收期提供科学依据。同时也避免了不适时宜的乱采乱挖葛根药材，造成葛根资源的浪费，为葛根资源的有效利用提供有效的、科学的保障。

总之，本实验建立的葛根中总黄酮含量的紫外分光光度测定法简便、准确、可靠，重复性良好，可用于葛根的质量评价。

[参考文献]

[1] 罗琼，郝近大，杨华，等.葛根的本草考证[J].中国中医药志，2007，32（12）：1141.

[2] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：北京化学工业出版社，2015：233.

[3] 董英，徐斌，林琳，等.葛根的化学成分研究[J].食品与机械，2005，21（6）：85-100.

[4] 狄灵，于燕，杨海侠，等.葛根素对心血管病作用机制的研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志，2009，7（3）：328-329.

[5] 杨艳.葛根素治疗冠心病心绞痛60例临床观察[J].临床合理用药，2009，2（8）：61.

[6] 吴慧轩.葛根素注射液治疗高脂血症疗效观察[J].中国中医药信息杂志，2003，10（7）：49-50.

[7] 程丽彩.葛根素对机体免疫系统影响研究进展[J].实用中医药杂志，2010，26（6）：440-442.

[8] 张艳梅，王越，董大伟，等.葛根的解肌作用及药理学研究[J].黑龙江医药，2010，23（3）：416-417.

[9] 白东义，佟春玲，韩慧，等.葛根素的药理作用及其临床应用研究进展[J].江苏中医药，2009，41（3）：76-78.

[10] 张东华，董强波，彭曙光.葛根的化学成分、药理作用和临床应用研究[J].首都医药，2007（12）：44-45.

[11] 郭建平，周全，孙其荣.葛根药理作用研究进展[J].中草药，1995，26（3）：163-165.

[12] 曾明，张汉明，郑水庆，等.葛属植物藤莖的化学成分分析[J].中国中药杂志，1999，24（3）：59-61.

[13] 刘建林，罗强.攀西野生葛资源的开发利用与可持续发展研究[J].中国林副特产，2004（6）：52-54.

（收稿日期：2017-03-02 本文编辑：李亚聪）