西妥昔单抗联合铂类化疗对人喉鳞癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤COX-2及MMP-7的影响*

龚永谦，程爱兰，刘洁

（1.南华大学附属第一医院 耳鼻咽喉科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学医学院 病理学教研室，湖南 衡阳 421001）

西妥昔单抗联合铂类化疗对人喉鳞癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤COX-2及MMP-7的影响*

龚永谦1，程爱兰2，刘洁1

（1.南华大学附属第一医院 耳鼻咽喉科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学医学院 病理学教研室，湖南 衡阳 421001）

目的 探讨西妥昔单抗联合铂类化疗对人喉鳞癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤环氧化酶-2（COX-2）及基质金属蛋白酶-7（MMP-7）的影响。方法 选择BALB/c裸鼠24只为研究对象，均复制人喉鳞癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤模型，随机分为西妥昔单抗组、顺铂组、西妥昔单抗联合顺铂组及对照组，各6只。对照组腹腔注射0.9%氯化钠溶液0.2 ml，西妥昔单抗组腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔单抗注射液，顺铂组腹腔注射3μg/ml顺铂注射液，西妥昔单抗联合顺铂组腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔单抗注射液和3 μg/ml顺铂注射液，连续4周后，脱颈处理裸鼠。比较瘤体生长情况、COX-2与MMP-7表达及信使核糖核酸（mRNA）表达。结果 西妥昔单抗组、顺铂组、西妥昔单抗联合顺铂组瘤体体积及瘤重均低于对照组（P＜0.05），西妥昔单抗联合顺铂组瘤体体积、瘤重低于西妥昔单抗组与顺铂组，抑瘤率高于西妥昔单抗组及顺铂组（P＜0.05）；西妥昔单抗组、顺铂组、西妥昔单抗联合顺铂组裸鼠肿瘤组织COX-2、MMP-7及mRNA表达均低于对照组（P＜0.05），西妥昔单抗联合顺铂组裸鼠肿瘤组织COX-2、MMP-7表达及mRNA表达低于西妥昔单抗组、顺铂组（P＜0.05）。结论西妥昔单抗联合铂类化疗有助于抑制喉鳞癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤增殖生长，可能与抑制肿瘤组织COX-2与MMP-7表达有关。

西妥昔单抗；顺铂；喉癌；环氧化酶-2；基质金属蛋白酶-7

喉癌是头颈部恶性肿瘤之一，占全身肿瘤的2%左右[1]，且有逐年增高的趋势，手术是治疗的主要方式。顺铂作为辅助治疗手段可有效保全喉结构与功能，但也存在严重胃肠道反应、骨髓抑制等毒副作用。西妥昔单抗是临床治疗头颈部肿瘤的靶向药物之一，可抑制血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶的生成，诱导肿瘤细胞凋亡，且不增加恶心、呕吐及骨髓抑制等并发症[2-3]。两组联合应用于喉癌的文献报道较少，本文通过复制人喉鳞癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤模型的方法，探讨西妥昔单抗联合顺铂化疗对人喉鳞癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）及基质金属蛋白酶 -7（matrix metalloprteinases-7，MMP-7）表达的影响，旨在分析其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/c裸鼠24只。雌性；4～6周龄；体重15～30 g，平均（22.45±3.12）g；购于湖南省疾病控制中心实验动物中心（许可证号SCXK20161015）。饲养条件：室温（25.01±0.56）℃，相对湿度50%～60%，常规饲养1周后进行实验。本研究经本院动物伦理委员会批准。

1.2 细胞株与药物试剂

人喉鳞癌Hep-2细胞（中南大学湘雅医学院动物实验中心提供），西妥昔单抗（德国莫克公司，注册证号 S2011009、规格 100 mg/20 ml、批号 151210），顺铂注射液（江苏省连云港恒瑞医药股份有限公司，国药准字 H20050962、规格 100 ml），COX-2 多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），MMP-7多克隆抗体（购自北京晶美生物工程有限公司），链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法（streptavidin-perosidase，SP）试剂盒（购自北京中杉金桥生物技术有限公司），二氨基联苯胺显色试剂盒（购自福建省福州迈新生物技术开发有限公司），Trizol试剂盒（购自美国Sigma公司），Taq DNA聚合酶、逆转录酶AMV（购自美国Progmega公司）。

1.3 主要仪器

超净工作台（江苏省苏州净化设备有限公司SWCJ-1F型），低温冰箱（日本 Sayyo公司MD-330），轮转式切片机（上海江文信息技术有限公司），光学相差显微镜（日本Olympus公司CKX41型），Qwin standard 2.8病理图像分析系统（德国Leica公司）。

1.4 复制模型与分组

将复苏后Hep-2细胞置于含10%小牛血清RPMI 1640培养基细胞液中，放至37℃培养箱内培养，细胞贴壁生长后取对数生长期细胞磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤，配成 108/ml单细胞悬液，于裸鼠右侧背部皮下注射100 μl，2周后观察皮下肿瘤结节情况，当肿瘤直径＞5 mm时提示模型复制成功。将模型复制成功的24只喉鳞癌模型裸鼠随机分为西妥昔单抗组、顺铂组、西妥昔单抗联合顺铂组及对照组，每组各6只。

1.5 药物干预

参照乔建兵等[4]的实验方法实施药物干预方案。对照组：腹腔注射0.9%氯化钠溶液0.2 ml，连续4周；西妥昔单抗组：腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔单抗注射液，连续4周；顺铂组：腹腔注射3μg/ml顺铂注射液，连续4周；西妥昔单抗联合顺铂组：腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔单抗注射液和3 μg/ml顺铂注射液，连续4周。

1.6 瘤体体积与瘤体重量

4周末脱颈处理裸鼠，分离移植瘤，用游标卡尺测量瘤体长径、短径，计算瘤体体积，同时称重，计算抑瘤率。将裸鼠肿瘤组织分为2部分：①用于免疫组织化学检测肿瘤组织COX-2、MMP-7蛋白表达；②用于检测瘤组织COX-2、MMP-7信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表达。抑瘤率=（对照组瘤体重量-实验组瘤体重量）/对照组瘤体重量×100%。

1.7 肿瘤组织COX-2、MMP-7蛋白表达

参照试剂盒说明书，采用SP法检测肿瘤组织COX-2、MMP-7表达，用PBS代替一抗作阴性对照，用肿瘤组织作阳性对照。判断标准：COX-2阳性细胞为细胞质可见棕黄色颗粒弥漫性分布，MMP-7阳性细胞为细胞质可见棕黄色颗粒染色。选择染色良好区域，采用图像分析软件进行定量分析。

1.8 肿瘤组织COX-2、MMP-7 mRNA表达

参照覃纲等[5]的方法检测肿瘤组织COX-2、MMP-7 mRNA表达，采用逆转录-聚合酶链反应法（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR），用Trizol法提取肿瘤组织总RNA完成逆转录，采用PCR反应提取终产物电泳后，使用凝胶分析系统分析目的基因及β-actin积分吸光值，再用Biod-rad软件分析mRNA表达水平。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料用均数±标准差（±s）表示，比较做方差分析，两组比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组瘤体体积与瘤体重量变化情况

4周后，4组裸鼠重量比较差异无统计学意义（P＞0.05）；实验组：西妥昔单抗组、顺铂组及西妥昔单抗联合顺铂组瘤体体积及瘤重低于对照组（t=6.173、6.466、8.272、2.509、3.057 和 5.347，P=0.010、0.009、0.004、0.032、0.021 和 0.013），且西妥昔单抗联合顺铂组＜顺铂组＜西妥昔单抗组＜对照组，差异有统计学意义（F=6.324和3.456，P=0.010和0.026）实验组抑瘤率比较，差异有统计学意义（F=4.324，P=0.018），西妥昔单抗联合顺铂组抑瘤率高于西妥昔单抗组与顺铂（t=8.984和 6.109，P=0.002和0.010），顺铂组抑瘤率高于西妥昔单抗组（t=2.781，P=0.028）。见表 1。

2.2 肿瘤组织COX-2、MMP-7表达

4周后，实验组：西妥昔单抗组、顺铂组及西妥昔单抗联合顺铂组裸鼠肿瘤组织COX-2、MMP-7蛋白表达均低于对照组 （t=7.356、8.262、10.705、8.259 、9.450 和 12.076，P=0.006、0.004、0.000、0.004、0.000 和0.000）；西妥昔单抗联合顺铂组裸鼠肿瘤组织COX-2、MMP-7表达低于西妥昔单抗组、顺铂组（t=7.051、7.211、5.921 和 5.579，P=0.008、0.007、0.012和0.014）。见表2。

表1 4组裸鼠重量、瘤体体积、瘤重及抑瘤率比较 （n=6，±s）

表1 4组裸鼠重量、瘤体体积、瘤重及抑瘤率比较 （n=6，±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与西妥昔单抗组比较，P ＜0.05；3）与顺铂组比较，P ＜0.05

组别抑瘤率/%对照组 24.35±2.02 1 102.36±202.34 0.84±0.18 -西妥昔单抗组 24.12±1.65 568.12±63.211） 0.60±0.151） 28.57±3.12顺铂组 24.03±1.57 545.20±60.161） 0.57±0.121） 34.52±4.212）西妥昔单抗联合顺铂组F值P值裸鼠重量/g 瘤体体积/mm3瘤重/g23.28±1.721.1020.086 402.15±45.361）2）3）6.3240.010 0.41±0.081）2）3）3.4560.026 51.19±5.322）3）4.3210.018

2.3 肿瘤组织COX-2、MMP-7 mRNA表达

4周后，实验组：西妥昔单抗组、顺铂组及西妥昔单抗联合顺铂组裸鼠肿瘤组织COX-2、MMP-7 mRNA 表达低于对照组（t=2.135、3.530、3.342、4.725、5.468 和 6.715，P=0.032、0.024、0.023、0.016、0.012 和0.010）；西妥昔单抗联合顺铂组裸鼠肿瘤组织COX-2、MMP-7 mRNA表达低于西妥昔单抗组、顺铂组（t=4.201和5.085，P=0.019和0.013)；顺铂组裸鼠肿瘤组织COX-2、MMP-7 mRNA表达低于西妥昔单抗组（t=2.939和 3.424，P=0.030和 0.026）。见表 3。

表2 4组裸鼠肿瘤组织COX-2、MMP-7表达比较（n=6，±s）

表2 4组裸鼠肿瘤组织COX-2、MMP-7表达比较（n=6，±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与西妥昔单抗组比较，P ＜0.05；3）西妥昔单抗联合顺铂组与顺铂组比较，P＜0.05

组别MMP-7对照组 138.69±22.14 136.45±18.21西妥昔单抗组 67.36±8.421） 70.02±7.521）顺铂组 60.25±7.121） 62.12±6.541）西妥昔单抗联合顺铂组F值P值COX-240.08±4.351）2）3）6.3250.009 43.02±5.251）2）3）8.6540.002

表3 4组裸鼠肿瘤组织COX-2、MMP-7 mRNA表达比较（n=6，±s）

表3 4组裸鼠肿瘤组织COX-2、MMP-7 mRNA表达比较（n=6，±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与西妥昔单抗组比较，P ＜0.05；3）与顺铂组比较，P ＜0.05

组别MMP-7 mRNA对照组 0.56±0.14 0.74±0.18西妥昔单抗组 0.41±0.101） 0.45±0.091）顺铂组 0.34±0.081） 0.36±0.081）西妥昔单抗联合顺铂组F值P值COX-2 mRNA0.22±0.061）2）3）4.0230.026 0.20±0.081）2）3）5.1230.01

3 讨论

随着现代医疗技术的不断发展以及肿瘤综合治疗手段的不断进步，在治疗喉鳞癌时，要求在不断提高生存率的前提下，通过治疗方式的改变，尽可能保留残留喉结构与功能[6]，提高患者生存质量。靶向治疗以其选择性地作用于肿瘤组织细胞、减少对正常组织细胞的损害，越来越受到关注。

西妥昔单抗为抗EGFE人/鼠嵌合单克隆抗体，可竞争性结合于表皮生长因子受体，抑制癌细胞增殖[7-8]；也可通过上调Bax表达与抑制Bcl-2表达诱导肿瘤细胞凋亡；通过下调基质金属蛋白表达抑制肿瘤细胞侵袭与转移[9]。也有学者研究报道，肿瘤细胞的发生、发展与肿瘤细胞增殖失控、细胞凋亡受限密切相关，西妥昔单抗可诱导Hep-2细胞株阻滞于S期，造成DNA损伤不能进行有丝分裂，从而阻止肿瘤细胞增殖失控[10-11]。本研究中，西妥昔单抗组肿瘤体积、瘤重低于对照组，且西妥昔单抗联合顺铂组肿瘤体积、瘤重均低于西妥单抗组、顺铂组，说明西妥昔单抗对肿瘤细胞的增殖、凋亡有积极的促进作用。

COX-2是花生四烯酸合成前列腺素限速酶，在组织中表达与细胞因子、炎症反应相关，可通过上调血管生长因子的表达促进肿瘤细胞局部浸润和远处转移[12]；MMP-7由肿瘤细胞分泌，可通过降解细胞外基质加速肿瘤细胞侵入周围组织，为肿瘤新生血管生长提供通道[13]。相关研究表明，COX-2、MMP-7在喉鳞癌细胞组织中均呈异常高表达状态[14-15]。本实验结果发现，西妥昔单抗组COX-2、MMP-7表达及mRNA表达低于对照组，西妥昔单抗联合顺铂组裸鼠肿瘤组织COX-2、MMP-7表达及mRNA表达低于西妥昔单抗组、顺铂组，王文慧等[16]、CHUN等[17]也有类似的文献报道。

综上所述，本研究结果表明，西妥昔单抗联合铂类化疗有助于抑制人喉鳞癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤增殖生长，可能与抑制细胞组织COX-2及MMP-7表达有关。本研究的局限性在于未对西妥昔单抗不同用药剂量进行比较，且缺乏对其可能作用机制的深入分析，有待今后作进一步的研究。

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Impact of Cox-2 and MMP-7 of cetuximab combined with cisplatin on human laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice transplanted tumor*

Yong-qian Gong1,Ai-lan Cheng2,Jie Liu1
(1.Department of Otorhinolaryngology,the First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;2.Department of Pathology,School of Medicine,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

ObjectiveTo study effects of Cox-2 and MMP-7 of cetuximab combined with cisplatin on human laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice transplanted tumor and its mechanism.MethodsA total of 24 BALB/c human laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice were established,and were divided into cetuximab group,cisplatin group,cetuximab combined cisplatin group,blank control group.The control group was treated with intraperitoneal injection 0.9%sodium chloride solution 0.2 ml,the cetuximab group with intraperitoneal injection 1,036 μg/ml cetuximab injection,cisplatin group with intraperitoneal injection 3 μg/ml cisplatin injection,and cetuximab combined with cisplatin group with intraperitoneal injection 1,036 μg/ml cetuximab injection and 3 μg/ml cisplatin injection.After four weeks,tumors growth,tumor tissue Cox-2 and MMP-7 protein expression and mRNA expression were compared.ResultsVolume and weight of tumors in the cetuximabgroup,cisplatin group,cetuximab combined cisplatin group were significantly lower than those in the control group(P＜0.05).Volume and weight of tumors in the cetuximab combined cisplatin group were significantly lower than those in cetuximab group,cisplatin group,inhibition rate were significantly higher cetuximab group,cisplatin group(P＜0.05).Expression of COX-2,MMP-7 protein and mRNA in cetuximab group,cisplatin group,cetuximab combined cisplatin group were significanlty lower than those in the control group(P＜0.05).Expressions of COX-2,MMP-7 protein and mRNA in cetuximab combined cisplatin group were significanlty lower than cetuximab group,cisplatin group (P＜0.05).ConclusionsCetuximab combination with cisplatin chemotherapy helps to inhibit laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice transplanted tumor proliferation and growth.It may related to inhibiting tumor tissue Cox-2 and MMP-7 expression.

cetuximab;cisplatin;laryngeal neoplasms;Cox-2;MMP-7

R696.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.005

1005-8982（2017）11-0026-05

2017-02-28

国家自然科学基金（No：81372894）；湖南省教育厅科研项目（No：10C1136）