不同葡萄糖转运途径相关基因的过表达对菌株葡萄糖代谢及产物合成的影响

刘冬冬，张伟国，徐建中，田成福

(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)

研究报告

不同葡萄糖转运途径相关基因的过表达对菌株葡萄糖代谢及产物合成的影响

刘冬冬，张伟国*，徐建中*，田成福

(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)

磷酸烯醇式丙酮酸-葡萄糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate-dependent glucose phosphotransferase system, PTSGlc)和不依赖于PTSGlc系统葡萄糖转运系统在葡萄糖转运和磷酸化过程中起重要作用。该文通过在葡萄糖代谢缓慢的L-赖氨酸产生菌Corynebacteriumglutamicum(C.glutamicum) ZL-8中过表达肌醇透性酶基因(iolT1)、葡萄糖激酶基因(ppgk)和EIIGlc基因(ptsG)，研究葡萄糖转运途径相关基因对葡萄糖代谢速率、L-赖氨酸及副产物合成的影响。与出发菌株C.glutamicumZL-8相比，重组菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1(葡萄糖激酶酶活力提高了768%)和C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG(PTSGlc系统酶活力提高了62.7%)葡萄糖消耗速率分别提高了16.7%和27.3%，L-赖氨酸产量分别提高了24.7%和16.4%。此外，有机酸和氨基酸分析结果表明，过表达不同葡萄糖转运途径基因对有机酸(丙酮酸、乳酸和乙酸)和副产物氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸)具有不同的影响。

谷氨酸棒杆菌；葡萄糖转运途径；葡萄糖代谢速率；L-赖氨酸

L-赖氨酸是人体及动物自身不能合成的必需氨基酸之一，广泛应用于饲料添加剂、食品添加剂及医药中间体等方面[1]。自1960年经紫外诱变选育了1株产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌缺陷型变异株，从此开始了发酵法生产L-赖氨酸[2]。目前用于选育L-赖氨酸生产菌的出发菌株多为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)及其亚种，如黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentus)等，而发酵生产L-赖氨酸糖质原料主要是葡萄糖。

在谷氨酸棒杆菌中，葡萄糖的吸收形式主要通过磷酸烯醇式丙酮酸-葡萄糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate-dependent glucose phosphotransferase system, PTSGlc)[3]以基团转移的方式进行(图1)。PTSGlc系统是葡萄糖特异性转运和磷酸化途径，是由酶I (EI)、HPr和EIIGlc组成的磷酸传递链[4]。首先EI以PEP为磷酸供体自身发生磷酸化，EI将来自PEP的磷酰基团依次传递给HPr、EIIGlc和葡萄糖，最后将葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸。其中，EIIGlc主要参与葡萄糖转运，是由2个亲水性胞质结构域(IIA和IIB)和跨膜结构域IIC(通常由约350个氨基酸残基形成6或8个跨膜螺旋)组成单肽链蛋白[5]。

图1 谷氨酸棒杆菌中葡萄糖转运途径简图[13]Fig.1 Glucose transport systems in C. glutamicum

随着对糖代谢的研究深入，近年来有研究者发现谷氨酸棒杆菌中存在着不依赖于PTSGlc系统葡萄糖转运途径。2011年IKEDA等[6]在谷氨酸棒杆菌中发现了不依赖PTSGlc系统葡萄糖转运途径，该途径由肌醇透性酶IolT1/IolT2(由基因iolT1和iolT2编码)和葡萄糖激酶(分别由ppgk和glk编码的PpgK和GlK)组成。此外，2015年IKEDA等[7]又在C.glutamicumATCC 31833中发现了另一条由EIIbglF透性酶和葡萄糖激酶组成葡萄糖转运途径(图1)。PTSGlc系统在参与葡萄糖转运和磷酸化过程中，需要大量消耗L-赖氨酸前体物质磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，并产生乙酸、乳酸等抑制菌体生长；而不依赖PTSGlc系统葡萄糖转运途径中，葡萄糖激酶是以ATP或多聚磷酸(polyphosphate, PolyP)为磷酸供体，不需要消耗PEP。另有研究表明，强化不依赖PTSGlc系统葡萄糖转运途径利用葡萄糖，可有效减小葡萄糖转运速率，使胞内糖酵解和柠檬酸循环之间的碳流代谢处于较为平衡状态，进而减少乳酸和乙酸分泌[8-10]，使菌体生长代谢较为平衡，积累更多的目的产物。张传志[11]、蔡恒等[12]研究表明，通过过表达iolT1和ppgk基因，可以提高目的产物苯丙氨酸、丁二酸产量，而在一定程度上降低副产物乳酸和乙酸等的积累。

本研究通过在C.glutamicumZL-8中过量表达来源于C.glutamicumATCC 13032的ptsG、iolT1和ppgk基因，分析出发菌株C.glutamicumZL-8及重组菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1和C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG在摇瓶发酵时葡萄糖消耗速率和L-赖氨酸产量，同时分析了发酵液中副产物，如有机酸和其他氨基酸的产量变化。研究结果可为基于遗传改造葡萄糖转运途径选育高产L-赖氨酸等氨基酸生产菌株提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验材料与试剂

1.1.1 菌株和质粒

C.glutamicumZL-8、E.coliJM109、E.coliBL21，穿梭表达质粒pDXW-8、pECXK-99E均为本研究室保藏，重组质粒pDXW-8-ptsG、pECXK-99E-ppgk-iolT1为本研究构建。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶EcoRI、XbaI、KpnI、pstI、sacI，T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、DNA Marker均购于宝生物工程有限公司，PCR相关试剂、基因组DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒和膜蛋白提取试剂盒均购于上海生工生物工程有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaC1 10，pH 7.0。

LBG培养基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉5，NaC1 10，葡萄糖 5，pH 7.0。

Epo培养基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，甘氨酸 30，异烟肼 4，NaCl 10，Tween 80 1，用于制备C.glutamicum感受态细胞。

完全培养基(g/L)：葡萄糖 5，蛋白胨 10，牛肉浸膏 10，NaCl 5，琼脂 20。

种子培养基(g/L)：葡萄糖 25，玉米浆 30，甜菜糖蜜 8，(NH4)2SO42，KH2PO42，MgSO4·7H2O 0.8，FeSO4·7H2O 0.025，MnSO40.025，硫胺素 0.001 1，生物素0.000 35，烟酰胺0.012 5，CaCO330。pH 7.0～7.2，0.1 MPa灭菌20 min。50 mL种子培养基装于500 mL三角瓶中，接种摇瓶培养，30℃、100 r/min 培养20～24 h。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖 80，(NH4)2SO445，玉米浆 20，甜菜糖蜜12，K2HPO41，KH2PO41，MgSO4·7H2O 1.5，FeSO4·7H2O 0.02，MnSO40.02，硫胺素0.000 45，生物素0.000 85，烟酰胺0.008，CaCO340。pH 7.0～7.2，90 kPa灭菌10 min，5 mL种子液转接到装有50 mL发酵培养基的500 mL的摇瓶中，30 ℃、100 r/min发酵60 h。

1.2实验方法

1.2.1 葡萄糖转运途径相关基因克隆及表达载体pDXW-8-ptsG、pECXK-99E-ppgk-iolT1的构建

根据NCBIC.glutamicumATCC 13032的全基因组核酸序列中葡萄糖转运途径相关基因序列(NCBI Reference Sequence: NC_003450.3)设计ptsG(NCgl130)、ppgk(NCgl1835)、iolT1(NCgl0178)的引物，并分别在基因ptsG和ppgk上游引物中引入合成的SD序列。各基因引物见表1。

表1 本研究使用的引物

提取C.glutamicumATCC 13032基因组DNA为模板，PCR扩增获得目的基因片段ptsG、iolT1、ppgk，各基因PCR扩增相关信息见表2。所得各基因片段经胶回收、酶切、与具有相同酶切末端的线性化质粒22℃连接过夜，转化E.coliJM109，经过抗性平板筛选，挑取转化子菌落PCR，选取较亮条带对应单菌落进行液体培养，提取质粒进行酶切验证(图2)，经测序验证正确。

表2 研究中PCR反应相关信息

1.2.2 重组菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG和C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1的构建

根据vander Rest等建立的方法[14]采用电转化法将构建成功的重组表达载体pDXW-8-ptsG和pECXK-99E-ppgk-iolT1电转化至C.glutamicumZL-8中，在卡那霉素终质量浓度为25 μg/mL的LBHIS固体平板上30 ℃培养36 h，挑选阳性转化子并液体培养，提取质粒进行单双酶切验证(图2)，验证正确后得到重组菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG和C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1。

1.2.3 酶蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表达

谷氨酸棒杆菌粗酶液制备[15]：离心收集菌体，所得菌体用50 mmol/L冰冷的KH2PO4(pH 7.0)洗涤2次，然后菌悬液通过超声破碎(100个循环，工作2 s，间歇3 s)，经4 ℃、10 000 r/min离心30 min除去细胞碎片，上清液即为粗酶液。所得上清液用于葡萄糖激酶酶活力的测定和SDS-PAGE分析；由于基因iolT1和ptsG编码的蛋白IolT1和EIIGlc为膜蛋白，因此谷氨酸棒杆菌膜蛋白的提取是利用购自生工生物工程(上海)股份有限公司的膜蛋白提取试剂盒，然后用于SDS-PAGE分析。其中，EIIGlc酶活通过测定PTSGlc系统酶活性间接反映。

1.2.4 葡萄糖激酶活性测定[16]

反应体系体积为1 mL，反应组成包括10 mmol /L葡萄糖、0.5 mmol/L NADP、4.5 mmol /L MgCl2、10 mmol/L PolyP20、5 mmol/L β-巯基乙醇及0.5 U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶。采用分光光度计法测定并绘制NADPH在340 nm的标准吸光曲线；然后取20 μL粗酶液催化反应体系，分别测定反应体系含10 mmol/L PolyP20和不含PolyP20时的吸光度D340 nm之差 (ΔD340 nm)，根据标准吸光曲线计算NADPH生成量。1个酶活力(U)定义为:每分钟催化生成1 μmol/L葡萄糖-6-磷酸所需的酶量。

1.2.5 PTSGlc系统酶活性测定

菌体预处理[17]：培养获得的菌体用0.2% KCl洗涤2次，然后加入5 mL含10%聚乙二醇6 000、二硫苏糖醇(30 mmol/L)和Tris-HCl(pH7.5,100 mmol/L)溶液重悬；向上述菌体中添加200 μL甲苯进行渗透，随后于室温下剧烈搅拌1min；最后得到的菌体用Tris-HCl缓冲液(pH7.5,100 mmol/L)洗涤2次，并用1 mL相同缓冲液重悬，用于测定PTSGlc系统酶活性。

酶活性测定[18]：反应组成包括Tris-HCl缓冲液(pH7.5,100 mmol/L)、PEP(10 mmol/L)、MgCl2(5 mmol/L)、二硫苏糖醇(30 mmol/L)、葡萄糖(10 mmol /L)、20 μL菌体处理液，反应体系总体积为0.5 mL(未添加葡萄糖时体积为0.45 mL)。反应体系在30℃预培养10 min，添加0.05 mL葡萄糖(100 mmol/L)开始反应，反应温度30 ℃、反应时间10 min，然后加入0.1 mL 30%偏磷酸终止反应。经过离心得到含有丙酮酸的上清液进行下一步实验。偶联反应组成：TES-NaOH缓冲液(0.5 mol/L，pH7.5)、NADH(0.15 mmol /L)50 μg乳酸脱氢酶(LDH)和0.1 mL PTSGlc反应上清液，反应总体积2.1 mL。反应添加LDH前后分别测定在340 nm处吸光度。采用分光光度计法测定并绘制NADH在340 nm的标准吸光曲线。1个酶活力(U)定义为:每分钟催化生成1 μmol丙酮酸所需酶量。

1.2.6 分析方法

菌体浓度测定：将发酵液稀释26倍，测定562 nm处的吸光值。

葡萄糖测定：将发酵液离心(9 000×g，2 min)除去CaCO3及菌体，然后稀释100倍，经生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。

有机酸含量测定：发酵液中有机酸含量的测定参照文献[19]采用高效液相色谱法。

氨基酸含量测定：发酵液中氨基酸含量测定参照文献[20]采用氨基酸自动分析仪。

葡萄糖吸收速率测定：在初始葡萄糖为80 g/L的发酵培养基中，接种量为10%，每2 h取样测定发酵液中葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗速率。

2 结果与分析

2.1表达载体和重组菌株的构建

以C.glutamicumATCC 13032基因组为模板，PCR扩增获得基因ptsG、iolT1和ppgk，先后经过纯化、酶切、与具有相同酶切末端表达载体酶连、转化E.coliJM109、菌落PCR，挑取阳性转化子，经液体培养提取质粒，质粒单双酶切及PCR进行验证(图2A)，各基因片段大小正确(表2)，以构建质粒载体为模板扩增各基因，测序比对正确，证明重组表达载体pECXK-99E-ppgk-iolT1、pDXW-8-ptsG构建成功。

A：M-DL15000 Marker； 1-基因ptsG PCR产物；2-基因iolT1 PCR产物；3-pDXW-8-ptsG SacI+SacII双酶切产物ptsG；4-pDXW-8-ptsG SacI 单酶切产物；5-pECXK-99E-ppgk-iolT1 KpnI+EcoRI双酶切产物iolT1;6-pECXK-99E-ppgk-iolT1 KpnI+pstI双酶切产物ppgk;7-pECXK-99E-ppgk-iolT1 EcoRI 单酶切产物 B-1 ZL-8/pDXW-8-ptsG SacI+ SacII双酶切产物ptsG;2-pECXK-99E-ppgk-iolT1 KpnI+EcoRI双酶切产物iolT1;3-pECXK-99E-ppgk-iolT1 KpnI+pstI双酶切产物ppgk图2 PCR产物及质粒pDXW-8-ptsG、pECXK-99E-ppgk-iolT1单双酶切验证Fig.2 Enzyme digestion and PCR analysis of the recombinant plasmid pDXW-8-ptsG, pECXK-99E-ppgk-iolT1

将构建成功的重组表达载体pDXW-8-ptsG、pECXK-99E-ppgk-iolT1电转化至C.glutamicumZL-8中，在卡那霉素终质量浓度为25 μg/mL的LBHIS固体平板上30 ℃培养36 h，挑取阳性克隆菌镜检，液体培养提取质粒进行酶切验证(图2B)，由图2B可知，重组菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG、C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1构建成功。

2.2不同葡萄糖转运途径相关基因在C.glutamicumZL-8中酶活性测定及SDS-PAGE分析

为了确定外源基因ppgk、iolT1和ptsG是否在ZL-8中正常表达，本文利用SDS-PAGE及酶活测定实验验证(如图3)，从3A中可以看出，在大小26.7 kDa有条带明显变粗且颜色加深，与基因ppgk编码蛋白PpgK大小一致，酶活测定分析重组菌粗酶液酶活力为0.27 U/mL，较出发菌株提高了768%，说明外源基因ppgk在C.glutamicumZL-8中成功表达；从图3B中可以看出，在54 kDa及72.6 kDa各处有一条带，且颜色稍深，分别与基因iolT1和ptsG编码膜蛋白IolT1、EIIGlc大小一致，EIIGlc活性可通过PTSGlc系统酶活性间接反映，预处理菌株测定PTSGlc系统酶活力，重组菌PTSGlc系统酶活力为2.21 U/mL，较出发菌株提高了62.7%，由此说明外源基因iolT1和ptsG在C.glutamicumZL-8中成功表达。

M-蛋白质标准分子量Marker;A:1-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1未经IPTG诱导膜蛋白;2-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1经IPTG诱导膜蛋白; 3-C. glutamicum ZL-8/pDXW-8-ptsG未经IPTG诱导膜蛋白;4-C. glutamicum ZL-8/pDXW-8-ptsG经IPTG诱导膜蛋白；B:1-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk未经IPTG诱导全细胞蛋白;2-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk经IPTG诱导全细胞蛋白;3-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1未经IPTG诱导全细胞蛋白;4-C. glutami-cum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1经IPTG诱导全细胞蛋白图3 C. glutamicum ZL-8中外源基因ptsG、iolT1和ppgk 蛋白表达电泳验证图Fig. 3 The electrophoresis of protein encoded by ptsG,olT1 and ppgk gene in C. glutamicum ZL-8

2.3不同葡萄糖转运途径相关基因过表达对菌体生长的影响

出发菌株C.glutamicumZL-8为葡萄糖代谢缓慢的L-赖氨酸产生菌，葡萄糖消耗速率缓慢。为了强化菌株的葡萄糖代谢能力，在出发菌株中过量表达葡萄糖转运途径相关基因ptsG、iolT1和ppgk，研究不同葡萄糖转运相关基因的过表达对菌体生长的影响。出发菌株和重组菌株摇瓶种子(图4A)和发酵生长曲线(图4B)。

表3 重组谷氨酸棒杆菌中蛋白酶活性测定

注：“-”没有检测。

■-C. glutamicum ZL-8；▲-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1；▽-C. glutamicum ZL-8/pDXW-8-ptsG图4 出发菌株和重组菌株菌体生长曲线Fig.4 The growth curve of the oringinal and recombinant strains

由图4A可知，重组菌与出发菌株生长趋势基本一致，但生长较为缓慢，并且最终菌体生物量也略低。由于摇瓶种子培养期间未添加诱导剂，重组菌中外源基因未表达及表达载体对菌体生长具有一定的抑制作用[21]，致使重组菌生长相对缓慢。从图4B可以看出，添加终浓度为1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)前(接种培养12 h时添加)，出发菌株生长快于重组菌株；发酵16 h至发酵结束，由于添加了诱导剂，重组菌中外源基因过量表达，生长速率加快、菌体生物量明显高于出发菌株，强化了菌株葡萄糖代谢能力。与重组菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1相比，重组菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG生长速率及最终菌体生物量稍高，但不明显。有研究表明[22]，不依赖于PTSGlc系统葡萄糖转运途径转运葡萄糖约占葡萄糖转运总数的15%。因此仅从菌体生长方面可知，过表达基因ptsG与同时过表达基因iolT1和ppgk并无明显区别。

2.4不同葡萄糖转运途径相关基因过表达对菌体葡萄糖消耗速率及L-赖氨酸合成的影响

摇瓶发酵出发菌株C.glutamicumZL-8及重组菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1、C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG，发酵期间定期取样测定葡萄糖含量和L-赖氨酸产量并绘制发酵曲线(图5)。

▲-C. glutamicum ZL-8；●-C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1；□-C. glutamicum ZL-8/pDXW-8-ptsG图5 出发菌株和重组菌株在摇瓶培养条件下葡萄糖消耗速率和L-赖氨酸产量Fig.5 The consumption rate and L-lysine yield of oringinal and recombinant strains in shake flask culture

由图5可知，发酵结束后出发菌株C.glutamicumZL-8发酵液中L-赖氨酸为38.3 g/L，重组菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG、C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1L-赖氨酸产量分别为44.6、47.7 g/L，与C.glutamicumZL-8相比，L-赖氨酸产量分别提高了16.4%、24.7%，同时发酵周期也分别缩短了12、8 h，说明重组菌葡萄糖代谢能力显著增强。重组菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG和C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1产酸速率基本一致，耗糖速率稍快于后者，而糖酸转化率稍低。由于PTSGlc系统转运葡萄糖效率高于不依赖于PTSGlc系统葡萄糖转运途径，消耗了大量胞内PEP，生成较多的丙酮酸及其衍生物质如乳酸、丙氨酸、缬氨酸等，使糖酸转化率降低。而不依赖于PTSGlc系统葡萄糖转运途径中葡萄糖激酶以ATP或PolyP为磷酸供体，从而积累较多的胞内PEP，更多的直接经磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化生成赖氨酸前体物质草酰乙酸，避免生成大量丙酮酸而降低糖酸转化率。

2.5不同菌株发酵液中副产物有机酸和氨基酸含量分析

LINDNER等[8]研究表明，过量表达基因iolT1和ppgk可降低副产物丙酮酸及其衍物质如乳酸、丙氨酸和缬氨酸等的积累。为进一步研究过量表达不同葡萄糖转运途经相关基因对L-赖氨酸发酵副产物如有机酸和其他氨基酸的影响，发酵赖氨酸结束后测定有机酸和氨基酸浓度。测定结果见表4。

表4 C. glutamicum ZL-8与C. glutamicum ZL-8/pDXW-8-ptsG、C. glutamicum ZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1发酵液中氨基酸和有机酸含量比较

发酵液中氨基酸测定结果表明，重组菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1和C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG发酵液中L-赖氨酸含量分别为47.7、44.6 g/L，较出发菌株的38.3 g/L分别提高了24.7%、16.4%。其他氨基酸如丙氨酸、缬氨酸和天冬氨酸含量变化较为明显(表4)，重组菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG发酵液中丙氨酸和缬氨酸较出发菌株C.glutamicumZL-8分别提高了19.6%、13.4%，天冬氨酸含量变化不明显；而重组菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1发酵液中丙氨酸和缬氨酸含量分别降低了22.9%、36.1%，天冬氨酸含量升高了46.7%。由于过表达基因ptsG，提高了葡萄糖转运速率，同时也生成了较多的丙酮酸及其衍生物质丙氨酸、缬氨酸等；而基因iolT1、ppgk的过量表达不以PEP为磷酸供体，降低了丙酮酸及其衍生物质的生成，而天冬氨酸积累量的提高，是由于天冬氨酸至L-赖氨酸合成途径中关键酶(天冬氨酸激酶)活性较低。

发酵液中有机酸测定结果表明，同时过量表达基因iolT1和ppgk降低了以PEP为磷酸供体葡萄糖的消耗，使更多的PEP直接经磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化生成草酰乙酸，降低了副产物如丙酮酸、乳酸、乙酸等的生成，重组菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1发酵液中乳酸、乙酸、丙酮酸含量分别为2.35、2.12、1.64 g/L，比出发菌株的3.69、2.72、2.23 g/L分别降低了36.4%、22.1%、26.5%；而过表达基因ptsG消耗较多的PEP，因此产生了较多的丙酮酸及丙酮酸衍生物质(有机酸)。重组菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG发酵液中的上述3种有机酸较出发菌株分别提高了30.6%、11.4%、42.1%。大量研究表明[8,11-12]强化不依赖于PTSGlc系统葡萄糖转运途，可使碳代谢更加平衡、副产物减少、主产物率提高等优点。

3 结论

本研究对葡萄糖代谢缓慢的赖氨酸产生菌C.glutamicumZL-8进行基因工程改造，克隆来源于C.glutamicumATCC 13032 EIIGlc基因(ptsG)、肌醇透性酶基因(iolT1)和葡萄糖激酶基因(ppgk)，构建重组质粒pDXW-8-ptsG、pECXK-99E-ppgk-iolT1，将重组质粒电转化至C.glutamicumZL-8，构建重组菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1、C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG，对重组菌株及出发菌株进行摇瓶发酵实验，与C.glutamicumZL-8相比，重组菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1葡萄糖激酶酶活力提高了768%，而C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsGPTSGlc系统酶活力也提高了62.7%，两重组菌菌体生物量明显提高、发酵周期分别缩短了8、12 h，说明重组菌葡萄糖代谢能力显著增强，L-赖氨酸产量也分别提高了24.7%、16.4%；同时测定发酵液副产物如有机酸和其他氨基酸，重组菌C.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1发酵液中副产物如乳酸、乙酸和缬氨酸等均有不同程度的降低，而重组菌C.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG发酵液中副产物均有一定程度升高。由于过量表达基因ptsG高效转运葡萄糖，一定程度上破坏碳代谢平衡，使得副产物增多、糖酸转化率降低；而同时过量表达基因ppgk和iolT1，葡萄糖消耗速率稍低于过表达基因ptsG，同时降低了以PEP为磷酸供体磷酸化葡萄糖的消耗，使更多的PEP经磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化生成草酰乙酸，避免生成大量丙酮酸造成碳代谢不平衡，也减少了不利于菌体生长物质如乙酸、乳酸等大量积累。

张传志[11]为了减少质粒使用，将整合基因ppgk-iolT1整合到基因组ptsI位点上；蔡恒等[12]发现调节因子IolR抑制葡萄糖激酶基因的表达，通过敲除基因iolR增强葡萄糖激酶基因的表达。为进一步强化菌株葡萄糖代谢能力、提高糖酸转化率、降低副产物，有必要缺陷PTSGlc系统、将ppgk和iolT1整合至基因组上，同时敲除抑制葡萄糖激酶表达基因iolR。

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OverexpressionofgenesrelatedtoglucosetransportsysteminCorynebacteriumglutamicumZL-8andtheireffectsonglucosemetabolismandL-lysinesynthesis

LIU Dong-dong, ZHANG Wei-guo*, XU Jian-zhong*, TIAN Cheng-fu

(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Corynebacteriumglutamicum(C.glutamicum) ZL-8 is anL-lysine producing strain of mutation breeding with low rate of glucose uptake and phosphorylation. Phosphoenolpyruvate-dependent glucosephospho-transferase system (PTSGlc) and PTSGlc-independent play an important role in the process of glucose uptake and phosphorylation. In this paper, the roles of EIIGlc, IolT1, glucokinase in glucose metabolic rate,L-lysine yield and by-products accumulation were investigated by overexpressing EIIGlc(ptsG), IolT1 (iolT1), glucokinase (ppgk)coding genes inL-lysine producing strainCorynebacteriumglutamicumZL-8. Compared with the original strain, theL-lysine yield and glucose metabolic rate of the recombinant strainC.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsG(increased by 27.3% and 16.4%, respectively) andC.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1(increased by 16.7% and 24.7%, respectively) were increased by overexpressing the genes in glucose transport system. In addition, the activity of PTSGlcsystem inC.glutamicumZL-8/pDXW-8-ptsGwas increased by 62.7%, whereas the activity of glucokinase inC.glutamicumZL-8/pECXK-99E-ppgk-iolT1 was increased by 768%. Meanwhile, results indicated that the accumulation of organic acids (pyruvic acid, lactic acid and acetic acid) and amino acids (valine, alanine, aspartic acid) changed more obviously during overexpression of the different genes involved in glucose transport system.

Corynebacteriumglutamicum; glucose transport system;glucose metabolic rate;L-lysine

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013796

硕士研究生(张伟国教授，徐建中讲师为通讯作者，E-mail：zhangwg168@126.com；xujz126@126.com)。

江苏省自然科学基金青年基金(BK20150149)

2017-01-10，改回日期：2017-03-28